摘要 目的：研究内苁蓉总苷对原代培养肝细胞的保护作用。方法：采用原位灌流法收集原代肝细胞，MTT法评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响；荧光显微镜技术评价肉苁蒙总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响；流式细胞仪检测肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响；免疫细胞化学染色 法检测内 苁蓉总苷对bd-2和c-fos表达的影响。结果：原代肝细胞经酒精损伤后，存活率降低，出现明显凋亡和坏死改变，凋亡抑制基因bcl-2减弱．促凋亡基因c-fos表达增强。肉苁蓉总苷可明显提高细胞存活率，改善凋亡和坏死情况，增强bcl-2 表达，抑制c-fos表达。且作用呈剂量依赖性，结论：肉苁蓉总苷可通过增加凋亡抑制基因bcl2表达，减少促凋亡基因c-fos表达，减少凋亡和坏死，增加细胞存活率来实现对原代培养肝细胞的保护作用。

关键词内苁蓉总苷；原代培养；肝细胞；酒精性肝损伤；凋亡

近年来，随着人们生活水平的提高，酒精消费量快速上升，伴随而来的是各种与酒精相关的疾病的增加，酒精性肝损伤是其中一个重要的问题。研究表明肉苁蓉具有增强机体的免疫功能、抗衰老、抗辐射、抗氧化以及抗脂质过氧化和对酒精肝损伤的保护作用”，苷类物质是肉苁蓉的主要活性物质，在前期的实验中通过动物试验证实肉苁蓉总苷可能通过减少自由基的产生，增强对自由基及其代谢产物的清除能力，从而抑制脂质过氧化，起到对酒精性肝损伤的保护作用，本实验将通过肝细胞原代培养，从细胞水平探讨肉苁蓉总苷对酒精性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 肉苁蓉总苷，深褐色粉末，由兰州大学药学院提供，含苯乙醇总苷88.6％。双蒸水溶解，培养液稀释成所需浓度，酶标仪（美国贝克曼库尔特AD340），荧光显微镜（Olympus，BX51），倒置相差显微镜（Leicn DM13000B），流式细胞分析仪（Beekman coulter cell.Cell Lab Quanta SC）等.

1.2 原代肝细胞分离培养 采用原位灌流法。取昆明小鼠1只，0.5％戊巴比妥0.5mL腹腔注射麻醉。常规皮肤消毒后开腹，将胃肠移向左侧。暴露门静脉，小心将输液器的输液针自门静脉远端刺入并结扎固定。将输液器的流量开至最大（约4mL／min），滴入经37℃预热的无钙预灌流液，待肝脏肿大，迅速自下腔静脉远端切断，间歇性压迫下腔静脉近端，使肝脏交替回缩与膨大。预灌流至冲尽残血，肝脏呈均匀黄白色时，换用预温的0.05％胶原酶（Sigma）灌流液进行消化灌流，当肝脏变软无弹性，肝包膜下出现小液泡，或

肝组织出现均匀裂隙时停止消化，小心游离肝脏，移至盛有适量DMEM高糖培养液（Sigma）的无菌平皿中，剥离肝包膜并轻轻振荡，即可将肝细胞散落于培养液中，收集于锥形管内，振荡培养10min（振频为100次／min），离心3mim（4℃，1000r／min），弃上清。用培养液悬浮细胞，200目尼龙网过滤，滤液反复离心3次（4℃，1000r／min），即获得肝实质细胞。调整细胞浓度为5x10°个／mL后，接种于用鼠尾胶原预处理的25ml培养瓶中．37℃．5％CO2孵育箱静置培养，24h后换液，弃去未贴壁细胞，继续培养，供后续试验使用.

1.3 原代培养小鼠肝细胞的生长曲线的测定

将分离纯化后的肝细胞调整至5x10个／mL接种于24孔板，每孔接种细胞悬液1ml，共接种21孔，含10％胎牛血清（Sigma）的DMEM高糖培养液培养7d．每天随机取3孔，0.25％胰消化吹打均匀后计数板计数，并绘制生长曲线。

1.4 酒精肝细胞损伤模型的建立 将以上述方法获得的呈对数生长的肝细胞接种于鼠尾胶原预处理的96孔板，每孔接种100L．10％胎牛血清的DMEM 培养液培养24h后换液，再培养24h，设空白组，50.75.100.125.150mmol／L五 个酒精干预组，每组设五个复孔，肝细胞与不同浓度的酒精培养24h后，每孔加0.5％的MTT（Sigma）20严L，再继续培养4h，弃上清液，每孔加DMSO 150严L，置摇床混匀15min，570nm检测吸光度值，并计算细胞存活率。

细胞存活率＝给药组OD值／对照组 OD值x100%

1.5 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响 将上述方法获取的肝细胞接种于鼠尾胶原预处理的96孔板，每孔接种100＃L，10％胎牛血清的DMEM培养液培养24h后换液，再培养24h后，给药组分别加入终浓度为0.2．0.4.0.8g／L的GCs，酒精模型组和空白组不加药继续培养，每组设五个复孔。24h后模型组和GCs干预组分别加入终浓度为100mmol／L的酒精，培养12h后，MTT法测定细胞存活率。

1.6 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响 将预先灭菌处理的盖玻片置于6孔板中，接种浓度为5x10个／mL的细胞悬液、设模型组、肉苁蓉组（0.2.0.4.0.8g／L）和空白组，培养24h后，加入终浓度为100mmol／L的酒精，培养24h后取出载玻片95％的乙醇固定15min，PBS洗两次，重新分散于PBS中，调整细胞浓度在5x10个细胞／mL加入10＃L的丫啶橙一溴化乙啶混合液（Sigma）（0.01＃g／mLY啶橙溶液．0.02＃g／mL溴乙啶溶液，混合体积比：1／1），孵育30min后，荧光显微镜下观察、摄像

1.7 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响 将消化好的细胞悬液密度调整为5X10个／mL接种于六孔板中培养24h后，设模型组．肉苁蓉组（0.2.0.4、0.8g／L）和空白组，培养24h后，加入终浓度为100mmol／L的酒精，孵育24h，消化收集细胞，PBS洗涤2遍后，用70％的预冷乙醇4C固定过夜，PBS液洗涤两次，加入RNA酶（Sigma），Pl（100＂g／mL）（Sigma）均匀染色，放入37℃水浴30min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.8 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡抑制基因bcl-2和促凋亡基因c-fos表达的影响

取6孔培养板三张，每3孔为一组，设模型组、肉苁蓉组（0.2.0.4.0.8g／L）和空白组，每孔置入1块无菌玻片，取对数生长期细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，调整细胞密度为5x10／mL，接种于6孔板，2ml／孔，培养24h后，加入终浓度为100mmol／L的酒精，继续培养24h，取出爬满细胞的玻片，PBS洗2遍，常规免疫组化ABC法染色，简要步骤如下：以40％多聚甲醛固定 10min，正常羊血清封闭30min，滴加beF-2多克隆抗体（Invitrogen）（1：75）或e-fos多克隆抗体（Invitro- gen）（1：50），室温反应1.5h，加入ABC复合物室温反应2h，DAB显色，明胶封片，光镜下观察并摄像，比较Bcl-2和c-fos蛋白表达。1.9 统计学处理 实验数据用SPSS 13.5软件

处理。以均数士标准差（x土s）表示，组间比较采用：检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养小鼠肝细胞的生长曲线 由图1可以看出随着孵育时间延长，肝细胞数不断增加。在第4天时进入对数生长期。

图1 原代培养小鼠肝细胞的生长曲线

2.2 不同浓度酒精对原代培养小鼠肝细胞存活率的影响 由表1可知，酒精对原代培养的肝细胞有很强的损伤作用，且作用呈剂量依赖性。结合试验需要，在后续的试验中将采用100mmol／L．作为工作浓度，其细胞存活率为43.40%.

2.3 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响 由表2可知，肝细胞经酒精损伤后，存活率明显降低，肉苁蓉总苷可以明显增加肝细胞存活率（P＜0.05）．且作用呈剂量依赖性（P＜0.05). 

表1 不同浓度酒精对肝细胞损伤情况比较（土＝5）

与对照组比较＊PK0.05．＊P＜0.01

表2 肉苁蓉总苷对肝细胞存活率的影响（土，5）

与梗型细PC0.05＊P＜0.01

2.4 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响 丫啶橙进入细胞后显绿色荧光，溴乙啶只能使细胞膜不完整的坏死细胞染色。通过观察发现（图2），空白组肝细胞呈均匀绿色，未见坏死细胞的溴红染色（A）；肝细胞经酒精处理后，细胞变小，出现了大量溴红染色的坏死细胞和核内染色质浓缩的凋亡细胞（细胞核呈亮绿色）（B），因此认为酒精在诱导肝细胞凋亡的同时，还可引起细胞的坏死。GC。可明显减轻坏死，减少凋亡，且作用与剂量呈正相关（C.D、E）.