2.5 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响 由图3-B可以看出，肝细胞经酒精损伤后，凋亡率明显增加（34.7％），肉苁蓉总苷可以明显增加肝细胞存活率，且作用呈剂量依赖性，该结果与荧光显微镜下观察所得结果一致。

经免疫细胞化学方法比较发现，肝细胞经酒精损伤后，凋亡抑制因子bc-2表达减弱（4-B），c-fos表达增强（5-B）。肉苁蓉总苷可明显增强bcl-

2表达（4-C、D．E），抑制e-fos表达（5-C、D、E）．结果见图4-5．

图4 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞tF2表达的影响（400

图5 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞e-fos 表达的影响（400）

A：空台红：马核型组：C．0.2gL-GCND：0.4g／L-GCw E40.8g／L-GC．

3 讨论

Berry等首先建立了生理条件下用胶原酶灌流肝脏获取肝细胞的原位灌流法，后来经过Seg-len等”发展，使这种胶原酶灌流技术更加完善。该法具有细胞产量大，存活率高等。本实验采用小鼠肝细胞原位灌流法获取原代肝细胞，并进行培养，方法稳定，细胞活性较强，通过生长曲线测定发现。获取的原代肝细胞4d即进入对数生长期

MTT比色微量分析法是一种检测细胞生长和存活的灵敏方法，重复性好，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将黄色的MTT还原为蓝紫色结晶物，而死亡细胞则无此功能。通过测定光密度即可反映细胞活性，本实验通过MTT法检测发现肝细胞经酒精损伤后，细胞存活率明显降低.肉苁蓉总苷可以明显增加肝细胞存活率（P＜0.05），且作用呈剂量依赖性（P＜0.05）．

凋亡是一种特殊形式的细胞死亡，当细胞发生凋亡时会出现特殊的形态学和生化学的改变-，实验证实当酒精处理后大部分肝细胞细胞发生了凋亡，细胞出现了明显的形态改变，表现为：细胞变小，细胞表面微绒毛消失，细胞表面皱缩、有空泡形成、细胞核聚缩、有凋亡小体形成等；同时伴有坏死产生，肉苁蓉总苷处理后凋亡率明显下降，坏死情况也有所缓解。

bc-2基因为原癌基因，目前已发现5个bel-2基因家族（bd-2．bcl-x．bax．mc-1和A1），其中bel-2可抑制细胞程序性死亡（PCD）．bcl-2的作用机理可能有：（1）抑制Ca的释放，bel-2是一种跨膜蛋白，其主要位于核膜上，核内外膜之间由内质网管腔相连，后者是细胞内Ca2＋的主要贮存场所，而Ca在细胞调亡过程中起重要作用。应用转基因方法发现bcl-2高表达可抑制内质网释放Ca，故推测bc-2对细胞凋亡的抑制作用可能与细胞内质网中Ca2有关。（2）bd-2通过阻止促调亡基因信号传递，或阻止这些诱导基因产物而发挥抗细胞调亡作用，研究表明bcF2蛋白可抑制P53．c-fox诱导的细胞凋亡等。（3）bel-2可通过抑制自由基而发挥抗凋亡作用，bd-2具有抗氧化剂作用，它可抑制超氧化物的产生和作用，从而抑制细胞凋亡的发生。

生，而持续过度表达与继发性损害有关。并认为二者的表达机制不一样，因此可以认为c-fos等IEG，起到双重作用。当修复防御系统完全被抑制时，它们参与凋亡；未被抑制时则对病灶周围的细胞有保护作用，参与细胞的修复及再生过程间.Webster KR用反义核苷酸降低c-fos的转录而阻止凋亡发生，表明c-fos过度表达与细胞凋亡有必然联系，与多种疾病的发生，发展有关。

在本实验中，肝细胞经酒精损伤后，凋亡抑制因子bel-2表达明显减弱，e-fos表达增强，提示肉苁蓉总苷可能通过增强bel-2表达，抑制c-fos表达.减少肝细胞损伤与凋亡，实现对肝细胞的保护作用.

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