摘要：目的：制备德赢vwin登录 提取物，分析主要成分，研究其通便作用。方法：测定德赢vwin登录 提取物中水分、灰分、总蛋白、多糖、总黄酮及总苷的含量；采用斑马鱼肠道染色荧光模型，观察德赢vwin登录 对斑马鱼肠蠕动的促进作用。结果：德赢vwin登录 提取物中的多糖是主要成分，含量为40.27%，总苷和总黄酮总含量近25%，另外含有少量的蛋白成分（7.61%），水分和灰分总含量不高于8%；德赢vwin登录 提取物在浓度为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 时对斑马鱼肠蠕动均有促进作用，呈现浓度依赖性，最高促进率可达23.26%，且在所有浓度下没有对斑马鱼造成死亡。结论：此提取物安全无毒，并且保证药效，可开发成预防或治疗便秘的保健食品或者药品。

关键词：德赢vwin登录 主要成分润肠通便斑马鱼尼罗红

随着饮食结构的改变及精神心理和社会因素的影响，便秘发病率有增加趋势，困扰越来越多的人[1， 2]。据统计，便秘在人群中的患病率高达27%，且有增加趋势[3]。便秘患者除会感到身体不适外，还有可能伴有失眠、虑、抑郁等心理障碍，严重者会出现腹痛、贫血和消瘦等症状[4]。便秘是临床上常见的慢性消化道疾病，通常以排便间隔延长、大便干结、艰涩不畅为主要症状，严重者可导致电解质和酸碱平衡紊乱，引起痔疮、下肢静脉曲张等

疾病[5]。长期便秘则可导致肠道细菌发酵产生致癌物质，刺激肠黏膜上皮细胞，产生异形增生，易诱发癌变[6]。因便秘发病率高、病因复杂，患者常有许多苦恼，便秘严重时会影响生活质量[7]。因此，预防和治疗便秘是保证人类健康并提高生活质量的一个重要方面。

德赢vwin登录 为列当科植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Sehrenk）R. Wight 的干燥带鳞叶的肉质茎，俗称红柳大芸，寄生于怪柳属植物红柳的根上，主要分布于我国新疆北部的和田、奇台、吉木萨尔县以及新疆南部的塔克拉玛干沙漠周围地区，以和田地区的民丰县和于田县产量最大[8， 9]。德赢vwin登录 具有益精血、补肾助阳、延缓衰老等功能，是我国稀有的名贵中药材，在《神农本草经》中被列为上品，为中医常用的补肾壮阳药物，被人们誉为“沙漠人参”[10]。其主要活性成分为苯乙醇总苷类物质，代表成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷，《中国药典》（2005 年版）正式收录[11]。近年来，国内外学者对于德赢vwin登录 的研究非常活跃，主要集中于德赢vwin登录 的免疫调节、神经保护、抗衰老、清除自由基、保肝等功效方面[12]。目前，对于德赢vwin登录 润肠通便药效的研究也有报道，但研究较少。屠鹏飞等对市场上常见的三种肉苁蓉类生药进行了润肠通便的药效比较，结果表明德赢vwin登录 药材的水煎剂可以促进肠蠕动、抑制大肠水分吸收和缩短排便时间[13]。张勇等通过肉苁蓉类药材及其炮制品通便作用比较研究认为，德赢vwin登录 药材的酒制品能增加小鼠小肠的推进度，缩短通便时间[14]。可见，目前对于德赢vwin登录 润肠通便的研究主要停留在对其原药材的方面，而对于德赢vwin登录 提取物用于预防和治疗便秘等疾病的研究尚未见报道。本文将德赢vwin登录 药材煎煮浓缩后，再经醇沉、干燥等工序制备提取物，并经斑马鱼体内实验验证其润肠通便生物活性，为德赢vwin登录 药材开发利用提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂：R-210 型旋转蒸发仪和V-700 型真空隔膜泵（美国步琪公司），Milli-Q Reference 纯水机（美国Millipore 公司），XS-205 型1/10 万电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），FreeZone 型冷冻干燥机（美国Labconco 公司），SMZ645 型解剖显微镜（日本Nikon 公司），AZ100 型电动聚焦连续变倍荧光显微镜（日本Nikon 公司）。乙醇为食品级，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.2 药材：德赢vwin登录 药材购自新疆和田天力沙生药物开发有限责任公司，经台湾“国防”医学院林汉钦教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Sehrenk）R. Wight 干燥的肉质茎，符合2015 版《中国药典》一部下规定，样品编号为20151106，储存于杏辉天力（杭州）药业有限公司研究所。

1.3 实验动物：斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，每次交配准备4～5 对成年斑马鱼。在受精6h 和24h 后对胚胎进行清理（移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。在温度为28℃条件下，用养鱼用水孵育胚胎（养鱼用水水质：每1L 反渗透水中加入200mg 速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH 值为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3）。因为胚胎可以从卵黄囊中获取营养物质，所以在受精后9d 内不需

要喂食。实验完成后，用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会（AVMA）对动物麻醉处死的规范要求。

2 实验方法

2.1 德赢vwin登录 提取物的制备：称取100kg 德赢vwin登录 药材，经清洗、浸润60min 后，切片（厚度5~8mm），再加入1000mL 纯化水回流提取3h，提取3 次，合并以上提取液，离心、过滤。滤液用旋转蒸发仪浓缩至密度为1.10g/mL 时停止浓缩，冷却至温度40℃，边搅拌边加入体积浓度为95%的乙醇，以调至醇的体积浓度约为65%。静置过夜，离心、去除上清液，沉淀物经真空干燥

得到11.2kg 德赢vwin登录 提取物。

2.2 德赢vwin登录 提取物成分测定方法：水分含量测定按照GB/T5009.3-2016[15]；灰分测定按照GB/T 5009.4-2016[16]；蛋白含量测定按照GB 5009.5-2016 中的凯氏定氮法[17]；多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[18]；总黄酮含量测定采用硝酸铝比色法[19]；总苷含量测定采用苯乙苷类测定法[20]。

2.3 最大非致死浓度（MNLC）的确定：将德赢vwin登录 提取物用养鱼水配制5 个浓度，分别为100μg/mL、211μg/mL、447μg/mL、946μg/mL 和2000μg/mL，同时设空白对照组。每个浓度均处理30 尾斑马鱼，处理期间，记录并统计每组斑马鱼死亡数量并及时移除。处理6h 后，统计各实验组斑马鱼死亡数量，绘制最佳的浓度效应曲线，并使用Origin 统计学软件计算MNLC 值。

2.4 对斑马鱼肠蠕动影响的评价：根据“2.3”项下确定的MNLC值，以浓度为MNLC/10、MNLC/3 和MNLC 的3 种浓度的德赢vwin登录 提取物处理经尼罗红喂养的斑马鱼，并设模型组和阳性对照组（多潘立酮），每组浓度（包括模型组和阳性对照组）均处理30 尾斑马鱼。处理6h 后，在荧光显微镜下拍照，每组随机拍摄数量为15 尾，利用NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件分析斑马鱼肠道总荧光信号（S，Total fluorescent signal），肠蠕动促进率=（1-S 药物/ S 模型）×100%。统计学分析采用方差分析和Dunnett s t–检验，P<0.05 表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 德赢vwin登录 提取物的化学成分分析：德赢vwin登录 提取物的化学成分见表1。

由表1 可知，多糖是德赢vwin登录 提取物的主要成分，含量为40.27%，总苷和总黄酮总含量近25%，另外含有少量的蛋白成分。

3.2 通便实验：斑马鱼是源自印度、巴基斯坦淡水河的一种小型热带淡水鱼，属于鲤科，与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，现已被美国国立卫生研究院列为继人和小鼠之后的第三大模式生物，近年来广泛被用于疾病模型建立和药物开发[21]。斑马鱼的个体小、易于饲养、胚胎透明易于观察和操作、样品用量少、试验周期短和可实现高通量筛选等优点，且肠道组成与人类非常相似，均由内皮细胞、结缔组织、环状肌和外纵肌组成，可用斑马鱼研究胃肠道生理功能[22]。尼罗红（9-二乙基氨基-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-酮）是一种荧光染料，可以标记活体细胞培养中的巨噬细胞、平滑肌细胞中的脂滴，因其无毒性，尼罗红染料在脂肪代谢疾病模型中广泛应用于活体染料[23]。当斑马鱼卵暴露于尼罗红溶液中，富含脂肪的组织卵黄囊能被结合，在荧光显微镜下清晰显示。当斑马鱼5～6d 时，大部分卵黄囊被吸收，斑马鱼开始自发肠蠕动摄食，可以观察到肠道中尼罗红的充盈情况，而不被其他组织吸收[24]。当斑马鱼摄入有助于促进肠蠕动的药物或者食物时，肠道荧光强度会减弱，可根据斑马鱼肠道蠕动情况来评价促进肠动力药物的药效。

3.2.1 斑马鱼肠蠕动实验测定浓度的确定：德赢vwin登录 提取物用养鱼水配制的100μg/mL、211μg/mL、447μg/mL、946μg/mL 和2000μg/mL 这五个浓度，处理斑马鱼6 h 后，统计斑马鱼死亡数量，如表2 所示。从表2 的实验数据可以看出，斑马鱼在德赢vwin登录 提取物五个浓度下，均没有诱发斑马鱼死亡，可见德赢vwin登录 安全无毒，MNLC 浓度即为2000μg/mL。基于此实验结果，确定斑马鱼肠蠕动实验的三个测定浓度，分别为200μg/mL、

667μg/mL 和2000μg/mL。

3.2.2 斑马鱼肠蠕动实验结果的分析：将发育至第5 天的斑马鱼幼鱼置于浓度为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 的德赢vwin登录 提取物溶液中，并设置模型组和阳性对照组（多潘立酮：2000μg/mL）。处理6 h 后，观察并在荧光显微镜下拍照，实验结果如图1 所示。

从图1 可以看出，未经任何药物处理的模型组中的斑马鱼肠道呈现强度较高的荧光，说明肠道染色成功。而经浓度为2000μg/mL 多潘立酮处理后的斑马鱼肠道呈现很弱的荧光强度，初步证实造模成功。再经浓度200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 的德赢vwin登录 提取物作用后的斑马鱼肠道的荧光强度信号值也呈现一定的变化，肠道荧光强度信号值如图2A 所示。由图2A 可知，经多潘立酮作用后，荧光强度信号值较低，也验证了阳性对照多潘立酮具有促进肠道蠕动作用。经三种浓度的德赢vwin登录 提取物作用后，荧光强度信号值随着浓度的提高而降低。根据荧光强度信号值，计算德赢vwin登录 提取物对斑马鱼肠道蠕动的促进作用，结果如图2B 所示。从图2B 可以看出，

德赢vwin登录 提取物对斑马鱼肠道蠕动具有明显的促进作用，随着浓度的提高，促进作用明显增强，呈现浓度依赖性，在浓度为2000μg/mL 时，促进作用达到了23.26%。由此可见，德赢vwin登录 提取物可以通过促进肠道蠕动，达到润肠通便的目的，也恰好印证了民间对于德赢vwin登录 的功效评价。

综上所述，德赢vwin登录 提取物具有较好的润肠通便作用，可以作为较好的润肠通便保健食品或者药品进行开发。对于促进肠道蠕动的机制尚不清楚，因此对其作用机制有待实验研究。此外，人类每天有不同程度的体力和脑力消耗且需要应对各种压力，这种情况下德赢vwin登录 提取物能否表现出润肠通便效果还需探讨。

4 结论

本文对德赢vwin登录 提取物进行了化学成分分析，结果表明多糖类化合物是德赢vwin登录 提取物的主要成分，含量在40%左右，总黄酮和总苷总含量近25%，还有少量蛋白类成分（7.61%）。斑马鱼体内实验结果显示德赢vwin登录 提取物在浓度为200～2000μg/mL 时均没有诱发斑马鱼死亡，说明德赢vwin登录 安全无毒。此外，斑马鱼肠蠕动实验表明德赢vwin登录 提取物可明显促进肠蠕动，并呈现浓度依赖性，在浓度为2000μg/mL 时，促进率可达23.26%。由此可以证实德赢vwin登录 提取物具有增强肠蠕动和促进排便的作用，但对于德赢vwin登录 提取物的作用机制尚不清楚，有待实验研究。德赢vwin登录 与荒漠肉苁蓉虽是不同种植物，但这两种植物均为列当科肉苁蓉属植物，同科同属植物具有类似的药理活性。据文献报道，荒漠肉苁蓉多糖具有清除自由基、免疫调节、抗衰老、改善脾虚、抗病毒、抗肿瘤、促进造血等多方面的药理活性，也有报道指出荒漠肉苁蓉的胶质多糖可以显著提高小肠推进度，缩短通便时间，有效地对抗阿托品的抑制排便作用，抑制大肠中水分的吸收[25-26]。而多糖也是德赢vwin登录 提取物的主要成分，可以推测多糖是德赢vwin登录 提取物的主要活性成分。对于德赢vwin登录 多糖进一步的成分研究和药理活性探讨正在进行。

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