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罗兰＇，王晓雯”，杨梅2，杨珊2，杨永新？
（1．新疆医科大学第一附属医院药剂科，新疆乌鲁木齐 830054；
2．新疆医科大学药学院药理教研室，新疆乌鲁木齐 830054；
3．新疆医科大学实验机能中心，新疆乌鲁木齐 830054）
［关键词］ 大鼠；学习；记忆；自由基；细胞凋亡：肉苁蓉总苷
【摘要】目的：探讨肉苁蓉总苷（GCs）对双侧颈总动脉结扎大鼠学习记忆功能的影响及其机制。方法：雄性SD大鼠，行双侧颈总动脉结扎术，以银杏叶片为阳性对照，术后2wk，进行大鼠跳台试验和Y-型迷官试验，观察GCs对大鼠学习记忆障碍的保护作用；并测定GCs对大风脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-过氧化酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性的影响；采用NBT染色法测定24h后脏梗死范围；行为指标采用11分制进行评分；TUNEL法检测脑细胞调亡。结果：GCs能提高双侧颈总动脉结扎所致的脑缺血大鼠学习记忆水平；提高脑组织SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量及AchE活性；改善神经症状；降低脑细胞凋亡率；缩小脑梗死范围；结论；GCs对双侧颈总动脉结扎大鼠认知功能障碍有防治作用，其作用机制可能与增强自由基清除酶活性，防止脂质过氧化反应，抑制细胞凋亡有关。还可能与通过抑制AchE活性，维持脑内乙酰胆碱（Ach）的正常水平有关。
［中图分类号］ R285；R965 ［文献标识码］A
血管性痴呆是老年性痴呆的一种主要类型。其中缺血性痴呆约占血管性痴呆的半数以上。缺血导致结构不可逆的损伤而出现痴呆症状”。肉苁蓉（herbacistanches）俗名大芸，为列当科植物，是一味著名的补益中药，具有补肾阳、益精血、抗衰老等功效 肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche.GCs）是从新疆德赢vwin登录 中提得，主要成分是苯乙醇总苷。本课题组多年来已对GC的抗氧化，清除自由其，抗脑缺血＊等药理作用进行了深入的研究 本实验采用永久性结扎双侧颈总动脉所致的脑缺血动物模型，观察GCs对脑缺血引起血管性痴呆模型大鼠学习记忆功能的保护作用，并探讨其抗血管性痴呆的作用机制。
材料与方法
药品与试剂 肉从蓉总苷（紫外方法测定纯度＞50％），由新疆医科大学药学院植物化学室按日本文献｜公开特许公报（A）昭63-198627］方法，从新疆德赢vwin登录 植物中提得，主要成分是苯乙醇苷类：银杏叶片（商品名：银可络，深圳海王药业有限公司，规格每粒含总黄酮苷19.2mg、萜类内酯4.8mg，批号：20040501）；氯化硝基四氨唑蓝（NBT）（季兰科技发展有限公司，批号：040819）；考马司亮兰CBBG％试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒、丙二醛（MDA）含量测定试剂盒，谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，乙酰胆碱酯酶（AchE）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，细胞凋亡原位检测试剂盒为德国宝君曼公司产品。
仪器 LSY型电热恒温水浴锅，北京医疗设备厂生产；电子天平，北京塞多利斯天平有限公司生产：LYJ-I型离心沉淀机，江苏响水医疗器械厂：
721分光光度计，上海第三分析仪器厂：WH-851涡旋混合器，上海环球物化仪器厂；TN型托盘式扭力天平，上海第二天平仪器厂；MC-B型迷宫刺激器，张家港市三兴教学机械厂；跳台（新疆医科大学机能实验中心自制）
动物分组及模型制备SD大鼠［许可证书编号：SCXK（新）2003-0011．雄性，体重（290±x30）g，由新疆医科大学实验动物中心提供，按照文献，稍加改进，大鼠经10％水合氯醛溶液300mg·kg＊腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈正中切口分离双侧颈总动脉，分别结扎双侧经颈总动脉的远，近端。缝合后伤口，每鼠肌内注射青霉素10万U（连续注射4d），放回笼饲养。假手术组大鼠仅行颈部切开，不结扎双侧颈总动脉，余处理组同双侧颈总动脉永久结扎术大鼠。大鼠随机分6组：（1）假手术组（对照组）；（2）模型组：（3）银杏叶片组（阳性对照组，剂量为6mg＊kg＇）；（4）GCs组（设低、中、高剂量组，剂量分别为40,80,160mgkg＇）。于造模前5d开始ig给药，假手术组和模型组g生理盐水，银杏叶片组和GCs组大鼠分别ig银杏叶片和CCs，每日1次，连续给药，共2wk观察指标及检测方法
1 大鼠术后存活情况 观察大鼠双侧颈总动脉永久结扎术2wk后存活情况：
2 行为指标评分于术后24h进行行为评分标准如下：提尾离开地面约30cm，左前肢表现为腕弯曲、肘屈曲、肩内旋或兼而有之者，计1-4分；将动物置于光滑平面上，轻推肩部使其向对侧移动，检查阻力情况，降低者根据程度不同计1～3分；根据左前肢肌张力下降程度差异，计1～3分；动物有向一侧不停转圈现象计1分 满分为11分，分数越高，动物的行为障碍越严重
3 脑梗死范围百分比测定 术后2wk，大鼠断头处死取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，浸人37℃、0.25％NBT溶液中温孵15min（即NBT染色）。正常脑组织呈现暗紫色，脑梗死区为白色。取出后置于10％甲醛溶液中固定，取出清洗浮色，称全脑重量及梗死区重量，计算后者占前者的百分比即为脑梗死范围百分比。
4 脑组织细胞凋亡的测定 采用TUNEL法，术后2wk，断头取脑，用10％甲醛溶液固定，石蜡切片，常规脱蜡脱水处理，滴加TUNEL反应混合物。37℃孵育60min，滴加转化剂-POD，37℃孵育60 min，滴加DAB底物溶液，室温孵育5～20min，光镜40x10倍下观察结果，每视野下计数100个细胞，计算凋亡细胞所占的比例。
5 跳台实验 术后2wk，将大鼠放在跳台仪内的橡皮台上适应3min，然后将大鼠放在铜栅上，接通电源（90V交流电），动物受到电击后逃避反应为跳上橡皮台。记录反应时间及5min内出现的错误反应次数，以大鼠学习过程中的反应时间和错误反应次数来评价学习记忆能力。
6 Y型迷宫试验 术后2wk，在暗室中进行，将大鼠放入三等臂Y型迷宫箱测试大鼠学习记忆能力，反应箱设3条通道，其顶端有1盏15W的信号灯，箱底可施以电击，训练小鼠按信号灯跑向安全通道。电压90V，10次·s的电刺激，同时记录大鼠是否能找到安全区的次数，每次时间为30s，共10次以大鼠的正确次数作为学习记忆成绩。
7生化指标 术后2wk断头取脑，制成10％脑匀浆，按试剂盒说明书测定SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性和AchE酶活性。考马斯亮兰CBB-SDS法进行脑组织蛋白质含量。
8 统计学方法 采用PEMS 3.0统计软件包，数据用均数±标准差（x±x）表示，组间比较采用秩和检验，方差分析q检验。
结果
大鼠术后存活情况 大鼠行双侧颈总动脉结扎2wk后，大部分动物自发活动减少，且随着缺血时间延长，死亡率增高，死亡率为36％，假手术组（对照组）大鼠术后无异常表现，死亡率为0％。
对双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的神经保护作用 所有动物均出现了神经症状，主要表现为提尾悬空时，左肩内旋，左前肢内收，肌力下降，行走时向左侧环转。大鼠脑出现明显的梗死灶。银杏叶片和GCs能改善大鼠的神经功能，缩小脑梗死面积，GCs具有神经保护作用。见图1和表1。
图2 GCs对双側颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠脑组织皮质和海马部细胞调亡的影响（x400） A：假手术组：B：模型组；C：服杏叶片组：D：CC组（160mg-kg＊组）
跳台实验 在跳台实验中，与假手术组相比，模型组反应时间延长（P＜0.01），出现的错误反应
图1 GCs对双側颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠脑梗死面积的影响 1：餐手术组：2：模型组：3：银杏叶片组：4：GC组（160mg·kg组）
表1 GCs对双侧颈总动脉结扎政脑缺血损伤型大服行为指标和脑梗死范围及脑细胞凋亡的影响 ¥01
组别 | 检药制量 mg·kg** | 行为指标评分 | 脑梗死范 | 胰细胞调亡 |
国／％ | %/* | |||
餐手术 | 0.40=0.10 | 3.241.4 | 4.0+1.9 | |
模型 | 9.8±1.4 | 19.3 | 16.3 | |
银查片 | 6 | 5.3.1.7 | 4.60.5 | 6.3x1.8 |
100 | 40 | 7.6+1.6 | 6.0:0.3 | 8.0+2.6 |
CC.1 | 80 | 7.2:1.2 | 5.910.6 | 4.9x2.0 |
GC. | 160 | 6.2.0.8 | 4.6+0.0 | 5.8±1.8 |
经秩和检验，方差分析和，检验：模型组与假手术组比较，P＜001：银查叶片组和CC，组与模型组比较，P＜0.01
GCs对所致大鼠模型脑组织细胞凋亡的影响 细胞测亡时，TUNEL法检测，光镜下可看到凋亡细胞呈现棕黄色，而正常脑细胞呈蓝染。实验结果显示GCs组和银杏叶片组凋亡细胞明显少于模型组（P＜0.01）。见表1和图2。图2 GCs对双側颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠脑组织皮质和海马部细胞调亡的影响（x400） A：假手术组：B：模型组；C：服杏叶片组：D：CC组（160mg-kg＊组）跳台实验 在跳台实验中，与假手术组相比，模型组反应时间延长（P＜0.01），出现的错误反应次数增多（P＜0.01），表明双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的被动回避反应能力降低；与模型组相比，GCs组和银杏叶片组，反应时间缩短（P＜0.01），错误次数减少（P＜0.01），提高了模型大鼠的被动回避反应能力。Y型迷宫试验 在迷宫实验中，与假手术组相比，模型组出现的错误反应次数增多（P＜0.01），表明双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的的空间学习记忆能力受损；与模型组相比，GCs组和银杏叶片组，提高正确次数（P＜0.05），提高双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的空间学习记忆能力。见表2。表2 GCs对双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠学习记忆（跳台法，2wk）及速宫实验的影响
组别 | 维药数量 mg·kg· | 5min内 反应时间A | 学习记忆 请误次数/次 | 进官实验正确次 数/1O次 |
假手术 | 2.00.5 | 1.3:0.5 | 7.7=1.7 | |
模型 | 62.35 | 5.7+2.9 | 3.6+1.3 | |
银查叶 | 片 6 | 10:5 | 1.7±0.8 | 5.3x1.5 |
100 | 40 | 13.7 | 2.8+1.41 | 4.6:1.1 |
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