朱军  赵希敏    刘勇

【摘要】目的 建立大鼠失血性休克复苏模型，观察肉苁蓉总苷（CTG）对缺血再灌注肾损伤的保护作用，方法 将SD大鼠随机分为假手术组、休克复苏组（实验组）、CTG组，每组10只，经造模后CTG组大鼠给予CTG 400mg／kg腹腔注射，实验组和假手术组注射3ml的生理盐水，分别检测各组血肌酐（Cr）含量、尿素氮（BUN）含量、胱抑素C以测定肾功能，流式细胞仪检测肾脏细胞凋亡率；酶联免疫法（ELISA）检测大鼠肾组织X-染色体连锁调亡抑制蛋白（XIAP）表达情况。结果 CTG组与实验组比较，血Cr．BUN和胱抑素C均明显降低（P＜0.01），肾脏细胞凋亡减少（P＜0.01），CTG可显著提高XIAP的表达（P＜0.05）。结论 CTG对大鼠缺血再灌注肾损伤具有保护作用，可能与促进XIAP的表达有关。

【关键词】肾：缺血再灌注损伤：肉苁蓉总苷：染色体连锁凋亡抑制蛋白：细胞凋亡

【中图分类号】R692    【文献标识码】A

缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I／R）损伤是失血性休克、严重创伤及肾移植、肾肿瘤手术等过程常见的肾功能损害病理生理现象。研究表明细胞凋亡是1／R损伤所致的肾功能损伤的重要环节。X-染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）是迄今发现的最强的内源性凋亡抑制因子之一国。有关XIAP在1／R损伤后肾组织的抗凋亡研究较少。肉苁蓉总苷（cistanche total glycosides，CTG）是从列当科植物肉苁蓉中提取分离出来的苯乙醇苷类化合物，生物功能多样，有关它在1／R损伤后的肾保护作用的研究尚少。本实验通过建立大鼠失血性休克复苏模型，建立全身性1／R损伤模型，探讨CTG预处理对I／R损伤肾脏的保护作用并探讨其可能的作用机制。

1  材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD 大鼠30只，由上海中医药大学实验中心提供，动物合格证编号：SYXK（沪）2009-0069，体质量（320±30）g。

1.1.2 实验试剂 CTG（购自浙江杭州杏辉天力药业有限公司，批号：20081516）：戊巴比妥钠（批号：P3761）、碘化丙啶（PI）、Rhodamin123（均购自美国Sigma 公司）：大鼠XIAP测定试剂盒ELISA Ki（购自上海科敏生物科技有限公司，批号CSB-EL026172MO)。

1.1.3 实验仪器 酶标仪（美国Thermo公司）：多参数生理检测仪（购自日本 NIHON KOHDEN 公司）：流式细胞仪（购自美国 Becton-Dikinson 公司）：24G套管针（山东洁瑞医疗器械公司）。

1.2  实验方法

1.2.1 动物模型的制备 SD大鼠实验前12h禁

食，戊巴比妥钠（50mg／kg）腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定，左下腹部作3cm的切口，分离股动脉，置入24G的套管针，连接多参数生理检测仪，20ml注射器肝素化接三通器放血，血压降至40mm Hg，认为休克开始，维持该血压90min，放血量为（13±3）ml，然后将注射器内的自体血缓慢回输，需要30min左右，血压恢复至基础值的90％以上，认为复苏成功。将套管针拔出，结扎股动脉，缝合切口。待大鼠清醒后放回饲养笼观察，自由进食水。在复苏后24h用戊巴比妥钠（50mg／kg）腹腔注射麻醉、剖腹，下腔静脉采血5ml，立即处死大鼠，取出左右双侧肾脏备用。

1.2.2 动物分组与给药 30只大鼠随机分为假手术组、休克复苏组（实验组）、CTG组，每组各10只。实验组放血前2h予3ml生理盐水腹腔注射，CTG组在大鼠放血前2h给予CTG，按400mg／kg的剂量注入腹腔。假手术组仅行麻醉、剖腹和分离股动脉置套管针以及缝合切口等，不行放血以及复苏，其余同实验组。

1.3  检测指标及方法

1.3.1 血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、胱抑素C的测定 Gr、BUN、胱抑素C由本院检验科负责测定。胱抑素C是一种肾小球滤过率变化的内源性标志物，当肾功能受损时，肾小球滤过率下降，胱抑素C在血液中浓度可增加10多倍，胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。

1.3.2 细胞凋亡率测定 流式细胞仪检测肾脏细胞凋亡率。取肾脏用刀片切碎，加少许PBS移入试管中。加入0.3％胰蛋白酶在37℃水浴箱中消化，孵育20min，待试管内物质变浑浊即加两倍的PBS以终止消化，用300目尼龙网过滤，弃去杂质，以低温离心机离心，1500g／s，离心5min，弃去上清液，调细胞浓度为1x106～1.5x10／ml，取以上细胞悬液0.4ml，加入10 μl／ml Rhodamin123 0.4ml，避光 37℃水浴箱孵育，试管加盖，30min 后加两倍PBS漂洗，然后以1500g／s离心5min，弃去上清液，同法再漂洗一遍。加P10.4ml，染色15min后上机检测肾脏正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞的百分率。依据各类细胞对此两种染料的亲和力得知，仅有PI着色的为死亡细胞，仅有Rhodamin123着色的为活细胞，两者均着色的为凋亡细胞。

1.3.3 酶联免疫法（ELISA）检测大鼠肾组织内XI-AP表达取各组肾脏，用组织裂解液处理新鲜肾组织。低温离心机 1500g／s离心5min，取上清按XI-AP ELISA Kit 试剂盒说明书操作，由上海交大丰核科技有限公司负责检测。

1.4 统计学处理

所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1 肾脏功能指标Cr、BUN、胱抑素C比较

实验组Cr.BUN、胱抑素C较假手术组均明显升高（P＜0.01），说明大鼠肾脏1／R模型制备成功。CTG组与实验组比较，Cr.BUN和胱抑素C值均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大家肾脏功能指标Cr．院N，脱抑素C情况比较（±）

注：与假手术组比较·＊P＜0.01：与实验组比较，P＜0.01

2.2 肾脏细胞凋亡率和肾组织内XIAP表达情况

假手术组肾脏组织只有极少数细胞发生调亡，实验组细胞凋亡明显增多，与假手术组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）：CTG组与实验组比较，细胞凋亡数减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）。假手术组仅有较微弱的XIAP的表达，实验组XIAP表达显著增加（P＜0.01）。与实验组比较，CTG组可显著提高XIAP的表达（P＜0.05）。结果见表2．

表2 各组大鼠肾脏细胞两亡率和XIAP表达情况比较（±x）

注：与假手术组比较＊P＜0.01：与实验组比较，P＜0.05．＊P＜0.01

3   讨论

 I／R 肾损伤的机制十分复杂，是多种因素作用下通过许多途径发生的病理过程，诸如钙离子超载、脂质过氧化损伤、细胞凋亡和坏死等，其中内源性半胱天冬酶（caspase）依赖的细胞调亡是I／R肾脏损伤诱导的肾小管上皮细胞损坏的主要形式之一0。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein． IAP）家族是至今发现的哺乳类细胞中唯一的easpase抑制物，能有效阻止细胞调亡的发生。XIAP是IAP家族中对cmspase 抑制作用最强的成员，可抑制多种病理刺激引起的细胞凋亡，对损伤器官起到保护作用。

目前肾1／R损伤动物模型的建立方法多为切除一侧肾脏，夹闭另一侧肾蒂或肾动脉，模拟肾移植的状态。笔者在本研究采用的是失血性休克／复苏模型，更加接近临床的创伤休克时出现的全身性缺血再灌注的病理生理过程，本实验中，SD大鼠的血BUN、Cr、胱抑素C量显著提高，肾功能严重受损，是较理想的研究1／R肾损伤等的动物模型。

CTG是中药肉苁蓉的重要药用成分，肉苁蓉，性温，味甘、咸，归肾、大肠经，始载于神农本草经。

《本经》曰：“主五劳七伤，补中，养五脏，强阴，益精气”《本草汇言》曰：“肉苁蓉，养命门，滋肾气，补精血之药也。”肉苁蓉在我国使用已有两千年，在历代增力配方中居第一位，在滋补配方中仅次于人参居第二位，肉苁蓉具有提高性功能，调节神经内分泌，提高机体免疫功能，抗氧化，促进物质代谢，保护缺血心肌等多种功能。

作为肉苁蓉主要药用成分，CTG的作用是多方面的。在脑缺血再灌注模型研究发现，CTG能够降低缺血再灌注后脑组织的兴奋性氨基酸对SD大鼠脑组织起到保护切。CTG对小鼠组织有抗氧化作用，对小鼠急性脑缺氧和小鼠心肌损伤有一定保护作用。CTG能够显著改善帕金森型小鼠的神经行为、抑制脑黑质多巴胺神经元的数量减少例。通过增强自由基清除酶活性、防止脂质过氧化、抑制β-淀粉样肽在脑内的沉积以及抑制脑细胞凋亡，CTC显著提高β-淀粉样肽所致阿尔茨海默病小鼠的学习记忆能力。本研究显示，应用CTG预处理后，SD大鼠血BUN、Cr、胱抑素C含量显著下降，肾功能损害减轻，CTG使得1／R损伤肾组织中凋亡抑制蛋白XIAP增加，阻断细胞调亡的发生，对损伤肾脏起到了保护作用。