摘要: 目的建立HPLC 法同时测定肉苁蓉属药材中松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷含量的方法。方法采用岛津Inertsil C18色谱柱( 4． 6 mm × 250 mm，5． 0 μm) ，以乙腈( A ) －0． 1%磷酸水溶液( B ) 为流动相，梯度洗脱。流速为1． 0 mL·min － 1 ，柱温20℃，检测波长为330 nm。结果松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷6 个成分的进样量分别在0． 240 ～ 2． 400μg ( r = 0． 9993) ，0． 300 ～ 3． 000 μg ( r = 0． 9998) ，0． 072 ～ 0． 720 μg ( r = 0． 9994) ，0． 006 ～ 0． 060 μg( r = 0． 9991) ，0． 150 ～1． 500 μg ( r = 0． 9999) ，0． 030 ～ 0． 300 μg ( r = 0． 9993) 线性关系良好; 平均回收率( n = 3) 在98． 81% ～ 101． 52% 之间，ＲSD 的范围为0． 3% ～ 2． 8%。含量测定结果表明，肉苁蓉和德赢vwin登录 中含量最高的成分依次为松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷; 肉苁蓉中均含有量较大的2' － 乙酰毛蕊花糖苷; 而德赢vwin登录 中检测不到; 二者均不含金石蚕苷和2'－ 乙酰金石蚕苷。盐生肉苁蓉主要的成分为松果菊苷、毛蕊花糖苷、2' － 乙酰毛蕊花糖苷，还有一定量的金石蚕苷。沙苁蓉的特征性成分为金石蚕苷和2' － 乙酰金石蚕苷，毛蕊花糖苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷含量极低，松果菊苷检测不到。结论建立的HPLC 方法可把肉苁蓉属4 种药材明确区分开来，方法简便、准确且重复性好，可望为肉苁蓉药材和饮片的质量评价和有效控制提供科学依据。

关键词: 肉苁蓉; 德赢vwin登录 ; 盐生肉苁蓉; 沙苁蓉; 苯乙醇苷; 松果菊苷; 含量测定

肉苁蓉属( Cistanche) 药用植物，我国主要分布有5 种，肉苁蓉C． deserticola、德赢vwin登录 C． tubulosa、沙苁蓉C． sinensis 和盐生

肉苁蓉C． salsa 最为常见［1］。肉苁蓉C． deserticola 和德赢vwin登录 C． tubulosa 作为肉苁蓉( Cistanches Herba) 的正品基原植物被我国药典所收载［2］; 而盐生肉苁蓉C． salsa 以及沙苁蓉C． sinensis 在民间也有一定的药用历史，但是多数情况认为盐生肉苁蓉是民间习用品，而沙苁蓉是伪品。文献报道这四种植物的特征性成分均为苯乙醇苷类成分［3 ～ 6］，并且药理研究表明该类化合物是肉苁蓉发挥药理活性的重要物质基础，具有改善学习记忆、抗衰老、抗疲劳、增强机体免疫力等活性［7 ～ 9］。

课题组通过市场走访调查发现，以上四种药材在市场均有销售，药材和饮片名肉苁蓉或盐生肉苁蓉; 以沙苁蓉冒充盐生肉苁蓉或肉苁蓉情况时有发生; 也有正品伪品掺杂在一起的情况。本研究收集了肉苁蓉属15 批药材或饮片( 市售12 批，采集3 批) ，在预实验基础上，建立了高效液相色谱法同时测定肉苁蓉属药材和饮片中6 种主要成分: 松果菊苷( echinacoside，1) 、金石蚕苷( poliumoside，2) 、毛蕊花糖苷( acteoside，3) 、异毛蕊花糖苷( isoacteoside，4) 、2' － 乙酰金石蚕苷( 2＇ － acetyl poliumoside，5) 和2' －乙酰毛蕊花糖苷( 2＇－ acetyl acteoside，6) 含量的方法，并对这些药材和饮片进行含量测定，为区分市售肉苁蓉药材的质量，鉴定药材真伪提供科学依据。

1 仪器与试药

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪( Thermo Fisher， chameleon色谱工作站) ，AB － 135S 分析天平、AL240 分析天平( 十万分之一，万分之一，瑞士梅特勒－ 托利多) ，KQ － 500DE 超声仪( 昆山市超声仪器厂) 。

对照品松果菊苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷购于上海源叶生物试剂公司，纯度≥98%，供含量测定用; 金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和2' － 乙酰金石蚕苷均为实验室自制，经MS，1H －13C NMＲ 和13C － NMＲ 确定结构，HPLC 峰面积归一化法测得纯度均≥98%( 对照品结构见图1) 。乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。15 批肉苁蓉属药材或饮片为采集或购自药材公司( 见表1) 。

2 方法与结果

2． 1 溶液的制备

2． 1． 1 对照品溶液精密称取对照品松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷适量，甲醇定容，分别配制成质量浓度为1． 0，2． 5，0． 6，0． 3，5． 0，0． 3mg· mL － 1的单一对照品储备液，并置于4℃的冰箱中保存，备用。

2． 1． 2 供试品溶液取药材粉末( 过四号筛) 约0． 1g，精密称定，精密加入70%甲醇溶液25mL，静置30min，称重，超声( 功率500W，频率40 kHz) 提取40min，待冷却至室温后称重，用70% 甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液并用0． 45μm 微孔滤膜过滤，即得。

2． 2 色谱条件采用岛津Inertsil C18色谱柱( 250 mm × 4． 6mm，5 μm) ，以乙腈( A ) － 0． 1%磷酸水溶液( B ) 为流动相，梯度洗脱( 0 ～ 8 min， 89% B→85% B; 8 ～ 13 min， 85% B→83% B; 13～ 20 min，83% B→78% B; 20 ～ 36 min，78% B→74% B; 36 ～ 48min， 74%B ) ，流速为1． 0 mL·min － 1 ，柱温20℃，检测波长为330nm，进样量10μL。在该色谱条件下，各组分的分离度均大于1． 5，理论塔板数均大于10000，色谱图见图2。

2． 3 方法学考察

2． 3． 1 线性关系考察精密吸取“2． 1． 1”项下的单一对照品储备液各1． 20，0． 60，0． 60，0． 10，0． 15，0． 50 mL 置于5 mL 量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。分别精密吸取上述混合对照品溶液1，2，4，6，8， 10 μL 注入液相色谱仪，按“2． 2”项下色谱条件进行测定，以进样量X ( μg ) 为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，线性方程、r 和线性范围见表2。

2． 3． 2 精密度试验取药材粉末( S15) ，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，连续进样6 次，记录峰面积，得出松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷峰面积的ＲSD 分别为1． 3%，1． 9 %，2． 6 %，3． 0 %，1． 8 %，1 ． 3 % ，表明仪器精密度良好。

2． 3． 3 稳定性试验取药材粉末( S15) ，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，分别于制备溶液后的0，2，4，6，8， 12h 内进样测定，得出松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷含量的ＲSD 分别为1． 3 %，1． 8 %，2． 4 %，2． 3 %，1． 7 %，1． 7 %，含量表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2． 3． 4 重复性试验取药材粉末( S15) ，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，平行制备6 份，进样测定，测得松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷的平均含量分别为6． 37，9． 89，3． 08，0． 15，2． 08 和2． 97mg·g － 1 ，ＲSD 分别为1． 8 %，2 ． 3 %，3． 0 %，2． 5 %，2 ． 4 %和2． 3 %，表明该方法的重复性良好。

2． 3． 5 加样回收率试验取已知含量的药材粉末( S15 ) 约0． 05 g，精密称定，平行称定9 份，分别精密加入相当于药材中6个待测成分含量的80%， 100%， 120% 倍量的对照品溶液，平行测定3 份，按“2． 1． 2”方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分的加样回收率及ＲSD，结果见表3，表明该方法准确度良好。

2． 4 样品含量测定分别称取不同批次的药材干燥粉末约0． 1g，精密称定，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，按“2． 2”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，按回归方程计算6 个化学成分的含量，结果见表4。

3 结论与讨论

3． 1 提取条件的优选本实验对不同提取方法( 加热回流提取和超声提取) ，提取溶剂( 水、30 % 甲醇、50 % 甲醇、70 % 甲醇、甲醇、30 % 乙醇、50 % 乙醇、70 % 乙醇、乙醇) ，浸泡时间( 0，0． 5，1 h) ，提取时间( 20，30，40，50，60，90 min) ，取样量( 0． 05，0． 10，0． 15，0． 20，0． 25 g) 进行单因素考察，最终确定，称取药材约0． 1g，加70% 甲醇25 ml，浸泡0． 5 h，超声40 min 为最佳提取条件。

3． 2 色谱条件的优化通过二极管阵列检测器进行全波长扫描( 210 ～ 400 nm) ，表明在330 nm 处6 个化学成分均有较大吸收，且杂质成分干扰较少，故选择330 nm 为检测波长。在流动相筛选时分别考察了乙腈－ 0． 10% 磷酸水，乙腈－ 0． 15% 磷酸水，乙腈－ 0． 20% 磷酸水流动相系统，样品中各成分色谱峰在乙腈－ 0． 10% 磷酸水流动相系统中分离程度最好，故最终确定此流动相。

3． 3 结论本研究在实地收集样品的基础上，结合药材及饮片的性状特征，并通过HPLC 预实验，可基本判断市售肉苁蓉属药材主要有如下几个来源: 两种药典正品肉苁蓉C． deserticola、德赢vwin登录 C． tubulosa; 民间习用品盐生肉苁蓉C． salsa; 非正品沙苁蓉C． sinensis( 民间疗效类似于正品) ; 还有的是正品和非正品掺杂。5 种来源样品在同一色谱条件下的代表性的图谱见图2B ～ 2F。由图2B、2C 和表4 可知，肉苁蓉和德赢vwin登录 中特征性成分以及含量最高的成分是我国药典检测的指标性成分松果菊苷( 1) 和毛蕊花糖苷( 3) ，其次为异毛蕊花糖苷( 4) ，肉苁蓉药材中均含有一定量的2' － 乙酰毛蕊花糖苷( 6) ; 而德赢vwin登录 中检测不到2'－ 乙酰毛蕊花糖苷( 6) ［10， 11］; 二者均不含金石蚕苷和2' － 乙酰金石蚕苷。由图2D 和表4 可知，盐生肉苁蓉含量极高的成分为松果菊苷( 1) 、毛蕊花糖苷( 3) 、2' － 乙酰毛蕊花糖苷( 6) ，还含有一定量的金石蚕苷( 2) 。由图2E 和表4 可知，沙苁蓉的特征性成分为金石蚕苷( 2) 和2' － 乙酰金石蚕苷( 5) ，毛蕊花糖苷( 3) 和2'－ 乙酰毛蕊花糖苷( 6) 含量极低，松果菊苷( 1) 检测不到。市售两批正伪掺杂样品( 图2F，表4) ，6个成分均可检测到。实验结果也表明正品肉苁蓉药材中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量差异也很大，这可能和产地、炮制加工等因素都有关。

本实验建立的HPLC 方法可把肉苁蓉属4 种药材明确区分开来，方法简便、准确且重复性好，可望为肉苁蓉药材和饮片的质量评价和有效控制提供科学依据。

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