王璐白雨朦李晓字！国旭升“ 霍东升“宋鬼”杨占君贾建新（包头医学院，1第三临床医学院，2巴彦淖尔临床医学院，3第一临床医学院，4人体解剖学教研室，包头 014040）

摘要 目的：探讨肉苁蓉总苷（GCs）对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习认知功能的影响及其作用机制。方法：双侧脑室注射AB1-42制备AD大鼠模型，连续给子模型大鼠不同剂量的GCs腹腔注射20d，Morris水迷宫检测各组大鼠空间学习记忆能力，尼氏染色观察海马CAI区细胞形态并计数正常锥体细胞：免疫组织化学测定脑组织突触素（SYN）含量、酶联免疫吸附试验测定血清超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）的含量。结果：GCs可明显缩短选避潜伏期与上台前路程，明显增加目标象限时间百分比与穿越平台次数：GCs能提高海马CA1区锥体细胞的存活率，明显增加SYN蛋白的表达和提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA的活性。结论：GCs改善AD学习认知障碍的机制可能是通过减少自由基堆积、清除体内过多的过氧化物，进面提高突触可塑性来改善学习认知功能。

关键词 肉苁蓉总苷：阿尔茨海默病：突触可塑性：自由基：大鼠

阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）是发生在老年前期或老年期的一种慢性中枢神经系统退行性疾病：以进行性记忆减退、认知功能障碍及心理精神状态改变为主要临床表现”；以大脑皮质萎缩、突触神经元丢失、老年斑（senileplaques，SP）沉积及神经原纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFT）为主要病理改变叫，关于其发病机制目前尚不明确。肉苁蓉（cistanch）为列当科植物，药效广泛，素有“沙漠人参”之美誉。肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche，GCs）是肉苁蓉的主要提取物，包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、挥发性成分、木脂素类、多糖、生物碱等。研究显示，GCs具有改善AD相关学习认知功能障碍的药理作用：但关于GCs改善学习认知的具体机制仍无定论，故研究GCs对AD模型大鼠学习认知功能的影响，并探讨其作用机制，以期为临床治疗AD提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

雄性6月龄Wistar大鼠70只（购自内蒙古大学动物实验中心），饲养于清洁级环境，自由进食进水。将动物随机分为以下7组（10只／组）：空白对照组（Control）、溶剂对照组（Vehicle）、假手术组（Sham）、模型组（Model）、肉苁蓉总苷低剂量组（25mg＊kg＊·d＇）、中剂量组（50mg·kg＊·d＇）、高剂量组（100mg＊kg＊·d＇）。空白对照组不给予任何处理：假手术组只进行侧脑室插管，但无液体注射：溶剂对照组侧脑室给予与模型组等体积的灭菌水：模型组给予双侧脑室可溶性Aβ1-42寡聚体注射（每侧10μg）：给药组给予模型动物肉苁蓉总苷对应剂量，肉苁蓉总普用灭菌水进行溶解，调整药液浓度，保证各组给药体积相同。动物通过灌胃给药，灌胃给药1次／日，连续给药20d。

1.2 AD动物模型制备

1.2.1 可溶性Aβ1-42寡聚体的制备

具体制备过程详见贾建新等相关报道。将Aβ1-42粉末溶解于预冷的六氟异丙醇至浓度为1mmol／L，面后分装到无菌微量离心管内。留取10μL作为聚合对照。用冷冻抽干机在真空条件下将Aβ溶液抽干后-80℃保存备用。聚合过程中先将抽干后的Aβ用二甲基亚砜溶解至5mmol／L，再用预冷的F-12／DMEM培养基稀释至200μmdl／L，4℃孵育24h。4℃，14000t／min离心5min，上清即为可溶性Aβ1-42寡聚体，将上清转移至新的EP管，4℃保存。去除离心管下方不溶的寡聚体。可溶性Aβ1-42寡聚体用前使用无菌PBS稀释至所用浓度（2μg／L）。

1.2.2 双侧侧脑室可溶性Aβ1-42寡聚体注射 大鼠经2％戊巴比妥钠（40～60mg／kg）腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪，颅顶备皮，常规碘酒消毒。至两侧眼眶之间向后沿颅骨中线切开颅顶皮肤约1cm，钝性分离皮下组织至颅骨外膜，反复用棉球擦拭切口，防止出血。充分显露矢状缝与冠状缝，暴露前囟（bregma）。参照大鼠脑图谱，以前囟为始点，向后0.9mm，中线左、右1.5mm处在颅骨表面用印度墨水做标记点：用牙科电钻在标记点垂直颅骨表面进行打孔，开直径1mm的骨窗，将微量注射器固定于脑立体定位仪的注射器夹持器上，垂直颅骨表面进针3.5mm（以颅骨外表面为基点）。5mn内缓慢注入5μLAβ1-42（2μg／μL），留针5min使其充分扩散，最后缓慢撇出注射器，对侧进行相同操作。注射完毕后，松弛注射器夹持器螺母旋钮，将动物从定位仪上撤下。手术全程动物体温维持在36℃～37℃，动物于麻醉清醒前单独放置。动物造模完成后，回笼饲养7d后鉴定模型制备是否成功。AD模型大鼠制备标准参照Christensen等1”相关文献报道。

1.2.3 蛋白标本、组织切片的存取和制备 全程实验结束后，动物腹膜腔注射常规麻醉。各组半数动物断头取脑，拨取海马冻存于超低温冰箱以备后用。半数动物剪开胸腔暴露心，将注射器针头从心尖部刺入左心室，用剪刀快速剪开右心耳；随后无菌生理盐水灌注，4％多聚甲醛进行前固定，等待固定效果满意后终止灌注：断头开颅取脑并用4％多聚甲醛后固定24h。修剪大脑组织块，选取上丘平面至视交叉的节段，常规脱水、透明、石蜡包埋。石蜡组织行冠状切片，制备片厚5μm的组织切片用于尼氏染色和免疫组织化学显色。

1.3 Morris水速言测试（Mocris water maze tout， MWM test)

定位航行实验历时5d，每天训练4次。记录动物定位航行实验的逃避潜伏期、上台前路程及平均游泳速度。第6天进行空间探索实验，记录动物120s内穿越平台的次数及在平台所在象限停留的时间百分比等指标。

1.4 尾氏染色及细胞计数

各组选取相同海马CA1区截面的切片进行尼氏染色。每张切片在CA1区随机选取3个视野（200倍），计数1mm长度内完整锥体细胞的个数，取其均数进行分析。

1.5 免疫组织化学显色

切片脱蜡至水，3％过氧化氢孵育5～10min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗5minx3次，高压微波抗原热修复，PBS洗5minx3次，10％山羊血清室温封闭30min，滴加多克隆兔抗突触素（synaptophysin，SYN），4℃过夜，PBS洗5minx3次，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育2h，PBS洗5minx3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，PBS洗5minx3次，DAB显色2min，自来水洗，苏木精复染，上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。