1.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）

各组动物实验全部结束后，10％水合氯醛（0.35mL／100g）溶液经腹膜腔注射麻醉。用一次性注射器从动物尾静脉抽取1mL全血留置于EP管中，放入冰盒。随后低温离心机4℃离心15 min（5 000t／min），取血清100μL备用。检测血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活 性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。ELISA操作步骤根据制造商试剂盒说明书（南京建成生物技术公司）进行。

1.7 免疫印连检测

从超低温冰箱中取出冻存的脑组织，称重后放入EP管中并加入蛋白裂解液，冰浴环境下超声波破碎蛋白数次。低温超速离心机离心15min，提取蛋白并测定蛋白浓度，将剩余的蛋白按每100μL样品蛋白加入33.3μ4x上样Buffer后振酱器混置于沸水中变性10min备用。配制浓缩胶和分离胶，蛋白上样并进行电泳：浓缩胶恒压80V电泳，根据膜的面积大小计算转膜电压，恒压湿转约60min：5％脱脂奶粉室温封闭1h后进行漂洗：SYN一抗（1：3000）4℃冰箱摇床缓慢过夜，次日取出T-TBS液漂洗：加入二抗室温避光孵育1h后避光漂洗：使用成像分析系统对条带进行统计分析。

1.8 图像处理和统计学处理

各组选取相同海马截面进行图像分析，张切片在CAI区随机选取3个视野（200倍）计数1mm长度内正常锥体细胞数，取均数分析。免疫组织化学显色结果用IPP 7.0图像分析软件进行光密度测定。实验数据采用SPSS 18.0软件进行分析，

图2 Morrs 水速宫测试检测内众蓉总苷对AD模型大原学习认知功能的作用

多样本均数比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两两比较采用SNK-q检验：多样本率的两两比较采用x分割法（partitions ofxmethod）。

2 结果

2.1 肉苁蓉总普对AD模型大鼠学习认知功能的作用

Morris水迷宫定位航行实验结果显示，逃避潜伏期（P＜0.05）与上台前路程（P＜0.05）各组间存在显著性差异。随着实验时间的增加，逃避潜伏期与上台前路程均逐渐缩短，溶剂对照组、假手术组与空白对照组相比无差异；模型组逃避潜伏期、上台前路程较空白对照组明显增加（P＜0.05）：低剂量组、中剂量组逃避潜伏期、上台前路程均较模型组明显缩短（P＜0.05），高剂量组与模型组无差异：平均游泳速度各组之间比较差异均无统计学意义（图1，见封三）。

空间探索实验结果显示，各组在目标象限的时间百分比差异存在统计学意义（P＜0.05），而假手术组、溶剂对照组与空白对照组比较无差异，模型组与空白对照组比较明显减小（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组、中剂量组在目标象限的时间百分比明显增加（P＜0.05），高剂量组与模型组比较无差异。穿越平台次数组间差异存在统计学意义（P＜0.05），面假手术组、溶剂对照组与空白对照组比较无差异，模型组与空白对照组比较穿越平台数明显减小（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组、中剂量组穿越平台数明显增加（P＜0.05），高剂量组穿越平台数与模型组比较无差异（图2）。

2.2 肉其蓉总普对AD模型大黑死亡率的影响

空白对照组、溶剂对照组与假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组给药全程结束后，动物没有出现死亡现象：而高剂量组给药过程中出现动物肠胀气、死亡现象，死亡率为30.00％，高剂量组死亡率与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.05）

2.3 肉苁蓉益普对AD模型大荒海马CA1区正常锥体细胞数量的作用

尼氏染色结果显示，模型组、高剂量组CAI区神经元减少，排列疏松紊乱，细胞形态大多异常、溶解坏死。低剂量组、中剂量组细胞形态规则、排列整齐、较致密，可见大量正常尼氏体，尼氏体呈紫色，核仁深染、清晰、居中，胞核不着色。空白对照组、溶剂对照组、假手术组细胞形态与低、中剂量组类似。海马CA1区锥体细胞计数显示，空白对照组、溶剂对照组、假手术组CA1区锥体细胞的数量最多，Aβ1-42注射可以明显导致CA1区锥体细胞数量减少（P＜0.05）：给予模型大鼠GCs干预后，低剂量组、中剂量组CAI区锥体细胞数显著增加，与空白对照组比较无差异，而高剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图3，见封三，表1）。

2.4 肉其蒙总普对AD模型大鼠突触相关蛋白表达的作用

免疫组织化学结果显示，空白对照组、溶剂对照组与假手术组海马CAI区SYN阳性细胞数较多，Aβ1-42注射可以使大鼠海马CAI区SYN阳性细胞数减少：体外GCs补充治疗一定程度上可以增加海马CA1区SYN阳性细胞数，低剂量组、中剂量组作用较为显著，与空白对照组比较无显著性差异，但与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）：高剂量组与模型组比较无差异（图4，见封三）。免疫印迹结果显示，空白对照组、溶剂对照组与假手术组海马组织SYN蛋白表达量较多，Aβ1-42注射可以使大鼠海马组织SYN蛋白表达量减少：体外GCs补充治疗一定程度上可以增加海马组织SYN蛋白的表达，低剂量组、中剂量组作用较为显著，与空白对照组比较无差异，但与模型组比较差异存在统计学意义（P＜0.05）：高剂量组与模型组比较无差异（图5）。

2.5 向苁蒙总普对AD模型大鼠氧化应激标志物的影

空白对照组、溶剂对照组与假手术组血清SOD、GSH-Px活性较高，MDA活性较低：与空白对照组比较，模型组血清SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA活性显著升高（P＜0.05）：给予GCs补充治疗后，低剂量组、中剂量组可以使模型大鼠血清SOD、GSH-Px活性显著升高，MDA活性量著降低：上述指标与空白对照组比较无差异，但与模型组比较差异存在统计学意义（P＜0.05）：高剂量组与模型组上述检测指标比较无差异（表1）。

图5 免疫印迹检测各组海马CAI区SYN蛋白的表达Fg5 Westera bot analysis of SYN protein espression leveh The expression levels are presented as ratio of SYN/B-actin. p<0.05 wa control:"p0.05 s model 

表1 GC、治疗对海马CAI区正常销体细胞数量，血清SOD、MDA与GSH-P的影响（x＊＊）

Tab l Efect of GCoa the aumber ef intact pyramidal cells in hippocampal CAL rgion,the levels of MDA

and the activay ofSOD and GSH-Px(as)

pe0.05.rscomrol:'P<0.05 vs model 

3 讨论

AD以学习认知功能障碍为主要临床表现，其主要的病理特征是胞外Aβ沉积形成的老年斑和胞内神经原纤维缠结。Aβ在细胞基质沉淀聚积可引起神经元细胞毒性及神经元纤维变性。本实验采用双侧脑室可溶性Aβ1-42寡聚体注射制备AD大鼠模型，Morris水迷宫实验结果显示AD模型大鼠学习认知功能显著降低，提示Aβ对学习认知功能具有明显的损害作用，该结果与既往报道相一致。

在正常老化过程中，神经元间信息传递的特化结构--突触的数量及完整性出现了不同程度的下降。突触是神经信息传递的关键部位，故突触的病理改变被认为是AD学习认知功能障碍的神经生物学基础＂，突触可塑性的降低是AD学习认知功能障碍的主要发病因素之一。既往文献报道，Aβ可诱导突触结构异常和功能失调，进面导致突触可塑性明显下降，故Aβ可能是引起AD学习认知功能障碍的最主要的发病因素4。研究显示，GCs具有改善AD相关学习认知功能障碍的药理作用4：文献报道显示，肉苁蓉提取物可以通过阻止Aβ的沉积改善AD模型大鼠认知缺陷，并且可以提高海马多巴胺能神经元功能（。笔者的前期研究显示，GCs治疗可以明显改善快速老化小鼠的学习认知功能障码，提高树突棘的数量与突触蛋白的表达，并可以减少Aβ的沉积，推测GCs可能是通过阻止Aβ的沉积，进而降低对突触可塑性的损害来改善AD模型大鼠学习认知功能障码，但GCs通过何种机制改善突触可塑性说法不一。

AD的发病机制尚未阐明，自由基堆积、细胞凋亡、突触功能的损害为日前较为公认的衰老学说＂。既往研究证明，GCs可以明显改善AD模型大鼠的空间学习记忆能力，GCs能显著增加快速老化小鼠海马CA1区锥体细胞数量、突触蛋白SYN与PSD-95蛋白的表达量，同时可以增加对氧化自由基的清除，故推测GCs改善AD相关空间学习记忆能力损害可能是通过抗氧化自由基损害，清除自由基堆积，进而提高突触可塑性从面提高学习记忆能力和认知功能7。本研究结果显示GCs可以提高海马CAI区正常锥体细胞的数量以及细胞形态，表明GCs能显著提高细胞的存活率。此外，GCs明显增加了海马组织树突棘的数量与SYN蛋白的表达，表明GCs提高了突触可塑性，GCs改善AD模型大鼠学习认知功能损害可能与提高突触可塑性相关。

既往研究显示，GCs具有抗氧化、抗衰老、清除自由基等功效8-。龚梦鹃等叫用不同剂量的肉苁蓉水煎液给阳虚证的小鼠灌胃，结果显示肉苁蓉水煎液可以降低丙二醛含量，升高超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活性：高占友等叫报道肉苁蓉对大鼠产生的运动性疲劳有一定的延缓作用，并且对运动造成的脑组织中氧化损伤线粒体和脂质过氧化的程度具有抑制作用。古力努尔·木特列夫等口的研究表明肉苁蓉中提取的松果菊苷（ECH）能够很好地抑制体外羟自由基、超氧阴离子自由基和脂自由基，提高GSH-px和SOD活性，降低MDA含量，抑制单胺氧化酶（MAO）活性，对D-半乳糖所致的衰老引起的氧自由基损伤有一定的修复作用。

本实验研究结果显示，GCs可以显著提高SOD和GSH-Px活性，相反降低MDA的活性：能够增强自由基清除酶活性，增强机体对自由基的清除活力，减少自由基对机体的损伤，防止脂质过氧化作用，保护细胞免受损伤，进面提高细胞的存活率。此外，GCs量效实验表明，25～50mg·kg-＇·d-＇的给药剂量改善模型大鼠的学习认知功能障碍的作用最为显著，高剂量组对学习认知功能几乎无改善作用。另外，在给药过程中，高剂量组容易引起动物肠胀气、死亡等现象，笔者推测可能是药物给药剂量过大，引起的毒性反应，故理想的给药剂量应该限制在50mg·kg-＇＊d-＇之内。今后的实验工作仍需要继续细化给药剂量，以期获得较为准确的给药剂量，避免药物的副作用以及动物、药物的浪费。

综上所述，笔者认为GCs改善AD相关学习认知功能障碍的机制可能是通过减少自由基堆积、清除体内过多的过氧化物，进面改善突触可塑性和提高细胞存活率来实现的，这将为GCs用于临床预防和治疗AD奠定理论和实验基础。

图版说明（图见封三）

图主内苁蓉总登对AD模型大学习认知功能的作用。A：选避潘伏期：B：上台前路程。＜0.05 acontrol：p0.05 vxmodel

图3 内东善总对AD模型大鼠海马CAI区正常银体细胞数量的作用，x200。A：空白对照组；B：假手术组：C：溶制对照组：D：模型组：E：低制量组：F：中制量组：G：高制量组。红色滴头示海马体细胞发生核固缩和坏死。

图4 免疫组织化学检测各组海马CAI区SYN的表达，x200。人：空白对照组：B：假手术组：C：溶制对照组：D：模型组：E：低制量组：F：中制量组：G：高列量组。红色箭头示免疫组织化学是色阳性细胞。