罗兰＇，王晓雯，时扣荣＇，顾伟鹰

（1．上海中医药大学附属第七人民医院药学部，上海 200137；2．新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830000）

【摘要】目的：探讨肉苁蓉总苷（GCa）对β-淀粉样蛋白致 Alzheimer病（AD）大鼠海马CA1区神经元病理形态学的影响。方法：将60只SD雄性大鼠随机分为6组，分别为假手术组、β淀粉样蛋白组（模型组）、维生素E阳性药组（VitE组）、GC40mg／kg组（小剂量组）、GCa80mg／kg组（中剂量组）、GCs160mg／kg组（高剂量组）。灌胃给药，1次／d，连续14d。给药结束后，处死大鼠，制备其脑组织切片备用。经苏木精-伊红染色（HE）和Bielachowskis银染色法观察海马CAI区神经元的病理结构改变，且通过电子显微镜观察神经元超微结构变化。结果：（1）GCs给药组的大鼠海马CAI区细胞排列整齐，形态正常，未见调亡坏死细胞，结构与假手术组类似。（2）GCs各给药组的大鼠神经元细胞核圆，核膜完整，核仁明显，线粒体结构完整，神经原纤维排列较整齐，结构几乎接近于假手术组和维生素E阳性药对照组。（3）GC给药组的大鼠海马CAI区神经原纤维排列较规则，神经元结构较完整，无明显肿胀、增粗，损伤明显减轻，组织结构基本接近于假手术和维生素E阳性药对照组。结论：GCs能减轻AD模型大鼠受损神经细胞的病理性改变及超微结构的损伤。

【关键词】阿尔茨海默病；肉苁蓉总苷；β-淀粉样蛋白；海马；神经元；大鼠

阿尔茨海默病（alzheimersdisease，AD）亦称老年性痴呆症，是一种老年神经系统退行性疾病，随人口老龄化，其患病率也明显增高，给国家、社会和家庭带来沉重负担。AD患者主要临床表现为记忆力减退、认知功能障碍以及人格改变等。对于AD发病机理和防治的研究已经成为近年来国内外关注的热点之一。较为公认的β-淀粉样蛋白（Aβ）级联反应假说认为：脑内在遗传及内外环境因素发生变化刺激下生成AB.Aβ在脑内的聚集，生成斑块、神经纤维缠结和tau蛋白磷酸化，进而产生神经毒性，造成神经突触损伤、神经元调亡，最终引发认知障碍。另外，中医认为老年痴呆的病因主要在于年老腑脏疲惫，心血渐耗。脑为髓海，“肾”与脑功能存在密切的联系，通过“补肾填髓”可以防治衰老引起的记忆力降低，起到“益脑髓”作用。与此同时，“补肾填髓”治疗方法已应用于临床多年，无论是在提高智能方面，还是在改善临床症状与体征方面，均获得了可靠的疗效。

肉苁蓉俗名大芸，为列当科植物，是味著名的药食两用的补肾益气类中药”，在民间已用于治疗老年性痴呆多年，效果颜住。日前市面上已有复方肉苁蓉益智胶囊问世，很有研究价值和应用前途。肉苁蓉总苷（glycusides of cistanche herba.CC.）是从 肉苁蓉中提取的一类多酚羟基类化合物，主要成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷两类苯乙醇总苷（化学结构式见图1），其有抗氧化“、清除白山基”、保护心肌缺血、抗辐射”、增加人体免疫功能、延缓衰老等功效。我国传统中医也认为补肾益精类中药肉苁蓉具有抗衰老、改善记忆的功效。另有研究发现，肉苁蓉总苷可改善实验性AD大鼠的记忆学习障碍，对脑组织损伤具有保护作用，这可归因于其抗脂质过氧化和抑制细胞测亡功效。这种抗脂质过氧化和抑制细胞凋亡作用与中医治疗AD的主要治疗原则“补肾填髓”相吻合。GC、不仅可以提高AD样大、小鼠脑组织中超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperusidase，GSII-Px）的活性，还降低了丙二醛（ma-londialdehyde，MDA）的含量，说明GC，可增强自由基清除酶活性，减少自由基对机体的损伤，防止脂质的过氧化作用，抑制细胞损伤＊-，但对于GC是如何作用于AD模型大鼠海马CA1区的病理形态改变，尚未见相关报道。本研究报将Aβss注入大鼠脑室海马致 Alzheimer病，建立实验性AD动物模型，观察GCs对该实验性AD大鼠海马CAI区的病理形态变化和超微结构的影响，观察GCs对大鼠脑内病变部位的改善情况，为中药治疗AD提供实验

依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

脑立体定位仪（中国人民解放军第二军医大学），Leica RM 2135切片机（德国菜卡公司），Ni-konYS100型显微镜（日本尼康公司），Leica HI1210展片机（德国莱卡公司），Motie Med 6.0 数码医学图像分析系统（Motie Med公司）JEDL-1230透射电子显微镜（日本）。

1.2 试剂

ABsss、DAB免疫组化显色试剂盒（Sigma化学公司）、药用维生素E（vitamin E，ViE）（上海建安制药厂）、硫代硫酸钠（西安化学试剂厂）、过碘酸（北京化工厂）、六次甲基四胺（天津市百世化学有限公司）、双色酸（上海试剂三厂）、磷钨酸（天津市化学试剂公司分公司）、灿烂绿（天津市汇英学试剂有限公司）、硝酸银（天津市大茂化学试剂厂）。所有化学试剂均为分析纯级别（analytically pure，AR）。

1.3 药材

肉苁蓉总苷由新疆医科大学药学院天然药物教研室从新疆肉苁蓉中提取。

1.4 动物

SPF级SD大鼠雄性大鼠60只，体重（250±20）g，动物及饲料购白新疆医科大学实验动物，实验动物生产证号：医动字第16-003号。

1.5 实验方法

1.5.1 AB的解有 将ABsss1mg溶解于200μL灭菌生理盐水中，制成5mmol／L的溶液，溶液密封后置于37℃细胞培养箱中，经7d后形成凝聚态，备用。

1.5.2 大鼠的给药方式 将60只试验大鼠随机分为6组，分别为阴性对照组（假手术组）、Aβ组（模型组）、VitERI性药组（VitE组），GCs40mg／kg组（小剂量组）、GCs80mg／kg组（中剂量组）、GCs160mg／kg组（高剂量纸）。灌胃给药，1次／d，连续14 d。

1.5.3 AD模型的建立 先用水合氯醛（400mg／kg）腹腔注射，以麻醉大鼠，并进行常规备皮消毒。然后，切开大鼠的颅顶部正中的皮肤，用脑立体定位仪固定大鼠。定位方式为：取平颅头位，确定右侧3.8mm、中线旁2.5mm，颅骨表面下达到3.0mm处为右海马背侧部。最后，回抽脑脊液，并用10μL微量注射器于5min内缓慢注入1μLAβsss，留针10min。建模方法参照文献报道（。

1.5.4 标本采集 电迷宫实验结束后，每组随机选取3只动物，用水合氯醛（400mg／kg）麻醉，依次剪开皮肤、胸腔，充分暴露心脏，剪开心尖部，以灌注针朝主动脉方向插入，止血钳夹闭，灌注生理盐水，于右心耳处，生理盐水灌注15-20min，至流出液变清，换用4％甲醛溶液继续灌注15-20min，直至动物全身僵硬，肝脏发白为止，然后断头取脑，用刀片切除前部脑端和后部小脑，将脑组织放入10％福尔马林溶液继续固定24h，石蜡包埋，制作大鼠海马CA1区4μm厚的横断面脑切片。切片分别用于苏木精-伊红（HE）染色和Bielschowskis银染色。

1.5.5 HE染色观寨实验性AD大风海马CAI 区超微结构 石蜡切片脱蜡、乙醇梯度脱水。二甲苯5 min，10 min（共两次），无水乙醇（1次）．95％酒精（两次）．80％酒精（1次）各5s，水洗。苏木素染液5-10mn。自来水洗，洗去多余染液。盐酸乙醇分化（将切片在盐酸乙醇内快速沾一下，立即人自来水使切片返蓝1min）。伊红染液3-5min。自来水洗，洗去多余染液。脱水（系列酒精：80％酒精、95％酒精、95％酒精、无水乙醇各5s）。透化（二甲苯两次各5s）取出封片。

在光学显微镜下观察：假手术组大鼠海马CA1区，细胞排列整齐，神经元细胞的中央有一个细胞核，形状圆面大，核内异染色质少，色浅，核仁内胞质丰富（图2A）。模型组可见散在大量的凋亡细胞，表现为细胞质为淡红色，浓缩样样；个别可见核碎裂，甚至核仁消失现象；局部神经元数目减少，并且神经纤维肿胀成宽带状或条索状，增粗（图2B）。与模型组比较，GCs给药组和VitE阳性药组，大鼠海马CAI区神经元结构基本正常，没有发现凋亡坏死细胞出现（图2C-2F）。

图2 大城海马CAI区病理结构的影响（HEx100）

ECC中制量丝（80mgkg）：FCC高剂量组（160mg／kg）。

2.2 GCs对实验性AD大鼠海马CAI 区超微结构的影响