罗兰”，阿尔孜古丽·吐尔逊b，王晓雯。

（新疆医科大学a.第一附属医院 药剂科；b.第一附属医院医学研究中心；c.药学院药理教研室，新疆乌鲁木齐 830054）

［关键词］ 肉苁蓉；PC12细胞；淀粉样β蛋白；细胞凋亡；阿尔茨海默病

［摘要］ 目的 研究肉苁蓉总苷（GCs）对β淀粉样蛋白25-35（Aβzsss）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的保护作用。方法 体外培养的大鼠PC12细胞分6组：正常对照组、模型组、银杏叶片组（40mg·L-）、GCs低剂量组（25mg·L-1）、GCs中剂量组（50mg·L-）和GCs高剂量组（100mg·L-1）。细胞培养至对数生长期时分别加入上述各组药物，每日1次。培养h96时，模型组、银杏叶片组和GCs各剂量组分别加入终浓度20μmol-L-的Aβzs3s，正常对照组以等体积培养基替代。继续培养24h和48h时，光镜观察各组细胞的形态及生长情况，MIT比色法检测各组细胞的存活率，分光光度法检测细胞中乳酸脱氢酶（LDH）活性，流式细胞术 Annexin V／PI法检测细胞凋亡率。结果 与正常对照组比较，模型组细胞数目显著减少，部分细胞皱缩，变圆、脱落的细胞数目较多，其存活率显著降低、LDH活性明显提高、凋亡率显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，GCs各剂量组细胞数目显著增多，细胞形态学变化明显改善，细胞的存活率增高、LDH活性下降、凋亡率降低，有非常显著差异（P＜0.01）。其中，GCs高剂量作用48h效果最显著。结论 GCs对Aβxs引起的PC12凋亡细胞损伤具有明显的保护作用。

β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）是正常情况下存在于细胞膜上的β淀粉样前体蛋白（APP）在β和y蛋白水解酶作用下，生成的由39～43个氨基酸残基构成的肽。其第25-35位氨基酸所组成的多肽片段是一个疏水性氨基酸的肽，体外水溶液中可形成稳定的聚集态，呈β片层状二级结构，具有神经毒作用。因此，Aβss常用于体外神经毒实验。

阿尔采末病（Alzheimer disease，AD，又名阿尔茨海默病）为慢性进行性神经性疾病，以认知功能和记忆损害、日常生活能力进行性下降及神经心理症状和神经行为异常为主要特征。大量实验研究证明，Aβ异常沉积是AD的重要病因，也是构成老年斑的主要成分。Aβ具有神经毒性，可引起动物学习记忆减退和认知功能障碍，还可出现神经退化和死亡。因此，由Aβ诱导的模型常用于AD发病机制的研究和药物筛选。肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche，GCs）是从新疆盐生肉苁蓉（herba cistanches）中提取的，主要成分是苯乙醇总苷。本课题组多年来已对GCs的抗氧化口、清除自由基、抗衰老、抗调亡等药理作用进行了深入研究。本研究在观察Aβ2sm诱导PC12细胞调亡的同时，探讨GCs对凋亡细胞的神经保护作用，为防治AD提供理论基础。

材料与方法

药品、试剂与仪器 DMEM／F1粉剂培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清购自杭州四季青工程材料研究所，甲基噻唑基四唑（MTT）为美国AMRESCO公司产品。乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（南京建成生物研究所），Vybrant凋亡检测试剂盒（美国Invitrogen 公司）。Aβxa（美国Sigma公司，批号：115K4778），银杏叶片（扬子江药业集团有限公司，批号：08092001）。GCs 由新疆医科大学药学院天然药物生药教研室按日本文献［公开特许公报（A）昭63-198627］方法，从新疆盐生肉苁蓉植物中提得，主要成分是苯乙醇苷类（批号：20070606）。

垂直流超净化台ZHJH-1214C（上海智城分析仪器有限公司），无菌二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（美国 Beckman Coulter公司），低温离心机（美国Thermo公司），PM-30倒置显微镜-计算机图像分析系统（日本Olympus公司）。

溶液与药物配制 Aβsm溶液的配制：取Aβsas1mg充分溶解于灭菌生理盐水中，使其浓度为1.0mmol-L，密闭后置37℃培养箱中1wk，-20℃冻存。实验前解冻，临时配制成所需浓度。药物配制：银杏叶片和GCs均用含血清的培养基配制至所需浓度，0.22μm滤膜过滤除菌，分装到无菌瓶中，-20℃冰箱避光保存。

细胞培养与分组 大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞购中国科学院上海细胞生物研究所。细胞常规培养，培养基含10％灭活胎牛血清和DMEM／Fn。细胞接种至96孔板，每孔加细胞培养液100μL，分为6组：正常对照组、模型组、银杏叶片组（40mg·L-）、GCs低剂量组（25mg·L-）、GCs中剂量组（50mg·L）和GCs高剂量组（100mg-L）。