关键词:抗骨增生片; 质量标准; TLC; HPLC; 淫羊藿苷

摘要:目的:建立抗骨增生片的质量标准。方法:采用TLC 法对处方中骨碎补、鸡血藤、熟地黄和肉苁蓉进行定性鉴别;并用HPLC 法对处方中淫羊藿苷进行含量测定，采用Phenomenex Gemini C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱，乙腈-水(30∶ 70)为流动相，检测波长为270 nm。结果:薄层色谱斑点清晰，易于识别，专属性强;淫羊藿苷在1. 734 μg /mL ～ 173. 4μg /mL 的范围内呈良好线性关系(r = 0. 999 9);平均回收率为100. 98%，RSD = 0. 6% ( n = 9)。结论:该方法准确灵敏、简便、重复性好，提高后的质量标准更有效的控制该制剂的质量。

抗骨增生片质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册［1］，是由熟地黄、鹿衔草、骨碎补、鸡血藤、淫羊藿、肉苁蓉、莱菔子组成的中药复方制剂，具有补肾，活血，止痛的功效，用于肥大性脊椎炎，颈椎病，跟骨刺，增生性关节炎，大骨节病。原标准仅有一项显微鉴别，为了更好地控制该制剂的质量，本研究按《中国药典》要求增订了骨碎补、莱菔子、熟地黄、肉苁蓉的薄层色谱鉴别，并增加了淫羊藿苷高效液相色谱含量测定方法，提高后的质量标准方法结果准确、操作简便，可作为抗骨增生片的质量标准。

1 材料、仪器和试药

1. 1 材料抗骨增生片为广州美晨药业公司及广东A、B药厂提供;柚皮苷对照品( 批号722-8601)、芒柄花素对照品( 批号200501 )、5-羟甲基糠醛对照品( 批号111626-200503)、甜菜碱对照品( 批号894-20001)、淫羊藿苷对照品(110737-200312);均购于中国药品生物制品检定所;阴性对照样品:由广州美晨药业公司提供。

1. 2 仪器安捷伦高效液相色谱仪:1100 系列; 瑞士卡马薄层色谱成像系统:CAMAGPEPROSTAR 3;日本岛津紫外可见分光光度计:UV-2501PC。

1. 3 试药与试剂烟台市化学工业研究所硅胶预制板;乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试药及试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2. 1 薄层色谱鉴别

2. 1. 1 骨碎补的薄层色谱鉴别取本品，除去包衣，研细，称取6 g，加石油醚(30 ～ 60 ℃)30 mL，水浴回流30 min，滤过，弃去滤液，药渣再加甲醇70 mL，加热回流40 min，过滤，蒸干滤液，加水20 mL 溶解残渣，乙酸乙酯每次20 mL，分3次提取，，合并提取液，蒸干，用水10 mL 溶解残渣，通过大孔吸附树脂柱(D101型，内径1. 5 cm，柱高15 cm)，加50 mL 水洗脱，弃去，再用40%乙醇90 mL 洗脱，弃去，最后加70% 乙醇100 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇2 mL 使残渣溶解，作为供试液。另取柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL 含0. 5 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VIB 薄层色谱法项下试验，吸取供试液及对照液各2 μL，点于

同一硅胶G 薄层板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(2∶ 17 ∶ 3 ∶ 3)的上层溶液，展开后取出，晾干，喷5% 三氯化铝的乙醇液，105 ℃加热5 min 后置紫外光灯(365 nm) 下观察。供试品色谱中，在与柚皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺骨碎补阴性对照液对上述方法无干扰。见图1。

2. 1. 2 鸡血藤的薄层色谱鉴别取本品10 片，除包衣，研细，加乙醇30 mL，水浴回流1 h，滤过，滤液浓缩至约2 mL，加入3 倍量硅胶，搅匀，烘干，装柱( 内径1. 0 cm，干法装柱)，加三氯甲烷50 mL 洗脱，蒸干洗脱液，加甲醇1 mL 溶解残渣，作为供试液。另取芒柄花素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0. 25 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VI B 薄层色谱法试验，分别吸取供试液5 μL 与对照液1 μL 点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为氯仿-甲醇(10 ∶0. 65)，展开后取出，晾干，置紫外光灯(365 nm) 下观察。供试品色谱中，在与芒柄花素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺鸡血藤阴性对照液对上述方法无干扰。见图2。

2. 1. 3 熟地黄的薄层色谱鉴别取本品，除包衣后研细，称取3 g，加30 mL 甲醇，超声30 min 后过滤，滤液蒸干后加2mL 甲醇溶解残渣，作为供试液。取5-羟甲基糠醛对照品适量，加乙醇制成每1 mL 含0. 5 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VI B 薄层色谱法试验，分别吸取供试液及对照液各1 μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯(1 ∶ 1)，展开后取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下观察。供试品色谱中，在与5-羟甲基糠醛对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺熟地黄阴性对照液对上述方法无干扰。见图3。

2. 1. 4 肉苁蓉的薄层色谱鉴别取本品，除包衣后研细，称取1 g，加甲醇20 mL，超声30 min 后过滤，滤液蒸干后加2mL 甲醇溶解残渣，作为供试液。取甜菜碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含4 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VI B 薄层色谱法试验，吸取供试液及对照液各1 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为丙酮-无水乙醇-盐酸(10 ∶ 6 ∶ 1)，展开后取出，晾干，喷改良碘化铋钾试液后置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与甜菜碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺肉苁蓉阴性对照液对上述方法无干扰。见图4。

2. 2 含量测定［2-4］

2. 2. 1 色谱条件填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶;流动相为乙腈-水(30 ∶ 70);流速为1. 1 mL/min;检测波长:270nm。在上述条件下供试品中淫羊藿苷与其他组分分离度大于1. 5。理论板数按淫羊藿苷峰计算为14 347。

2. 2. 2 对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，精密称取，制成每1 mL 含淫羊藿苷35 μg 的甲醇溶液。

2. 2. 3 供试品溶液的制备取本品10 片，除包衣后研细，精密称取0. 4 g 置三角瓶中，精密加入50 mL 70% 乙醇溶液，密塞，称重，超声(功率250 W，频率40 kHz)10 min，放冷后再称定重量，以70% 乙醇补足减失的重量，摇匀后滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

2. 2. 4 阴性对照溶液制备取淫羊藿阴性对照样品，按

2. 2. 3项下制备方法制成阴性对照液。

2. 2. 5 准确度试验

2. 2. 5. 1 对照品溶液制备精密称取淫羊藿苷对照品0. 014 78 g，置100 mL 量瓶，加70%乙醇适量溶解后稀释至刻度，摇匀，作为准确度用淫羊藿苷对照品溶液( 每1 mL 含淫羊藿苷147. 8 μg)。

2. 2. 5. 2 供试品溶液的制备精密称取抗骨增生片样品(批号MC00106，含淫羊藿苷1. 21 mg /片) 共9 份，置具塞三角瓶中，精密加入上述准确度用对照品溶液适量( 见表1)，再按2. 2. 3 项下精密加70%乙醇溶液50 mL 起操作，结果平均回收率为100. 98%，RSD = 0. 6%(n = 9)。见表1。

2. 2. 6 精密度

2. 2. 6. 1 重复性试验取相同批号的抗骨增生片6 份，按

2. 2. 3 项下操作，结果6 份样品RSD 为0. 6%，表明重复性良好。

2. 2. 6. 2 中间精密度试验由甲、乙、丙三人用同一台设备，在不同的时间，按拟定方法测定相同批号的抗骨增生片，结果三者RSD 为0. 7%，表明精密度良好。

2. 2. 7 专属性分别取供试液、淫羊藿苷对照液及淫羊藿苷阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，结果表明阴性对照液对本方法无干扰。见图5。

2. 2. 8 线性对照品贮备液的制备称取淫羊藿苷对照品0. 017 34 mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(浓度:0. 346 8 mg /mL)。精密吸取对照品贮备液0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、5. 0、10. 0 mL，分别置20 mL 量瓶中，加甲醇并稀释至刻度，摇匀，吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，平行两次进样，以淫羊藿苷浓度(μg /mL)为横坐标，峰面积平均值为纵坐标，得回归方程为: Y =19. 783X + 5. 378 1，r = 0. 999 9，表明在淫羊藿苷在1. 734 ～173. 4 μg /mL 范围内线性良好。

2. 2. 9 被测溶液的稳定性取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，分别间隔0、1、2、4、6、10 h 进样，结果RSD 为0. 5%，表明被测溶液在10 h 内稳定性良好。

2. 2. 10 耐用性

2. 2. 10. 1 流速的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，分别在0. 8、1. 1、1. 5 mL/min 的不同流速情况下进行测定，淫羊藿苷含量测定结果RSD 为1. 8%，表明淫羊藿苷含量测定结果不受流速的影响。

2. 2. 10. 2 色谱柱的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，使用3 种不同色谱柱( 迪马Diamonsil C18;4. 6mm × 250 mm，5 μm;Phenomenex Gemini 5 μm C18 110A 250mm × 4. 6 mm; 依利特Kromasil C18 5 μm，4. 6 mm × 200mm)，结果3 支柱子RSD 为1. 5%，表明色谱柱对不影响该方法的结果。

2. 2. 10. 3 流动相比例的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，在流动相配比分别为(28 ∶ 72)、(30 ∶ 70)、(32 ∶ 68) 时进行测定，淫羊藿苷的含量测定结果RSD 为0. 9%，表明在流动相配比发生微小变化时，该试验测定结果影响不大。

2. 2. 10. 4 柱温的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，在20 ℃、30 ℃、40 ℃ 柱温下测得结果RSD 为1. 5%，表明柱温对该试验影响不大。

2. 2. 11 10 批样品含量测定取不同批号不同厂家的抗骨增生片10 批，按拟定方法试验，结果见表2。

3 讨论

3. 1 小结本研究对建立的薄层色谱方法进行了耐用性的考察，对不同温湿度及不同的板材( 手铺板、市售预制板) 下的展开效果进行对比，结果良好;含量测定方法按中药质量标准分析方法验证指导原则［5］进行方法学验证，准确度好，方法可行。

3. 2 含量测定项下波长的确立在200 ～ 320 nm 波长范围内扫描淫羊藿苷对照品的甲醇溶液，结果在270. 9 nm 波长处有最大吸收，与文献所用的最大波长(270 nm) 基本一致，故选择270 nm 为本品的测定波长。

3. 3 流动相的选择流动相曾试用:(Ⅰ) 乙腈-水(30 ∶70);(Ⅱ)甲醇－ 1%冰醋酸溶液(55 ∶ 45);(Ⅲ)甲醇-水(60∶ 40)，结果表明流动相Ⅰ板数高，分离度好，故选择其为本试验流动相。

3. 4 提取溶剂的选择为寻找合适的提取溶剂，取同一供试品，分别用70%乙醇、甲醇、流动相进行提取，三者结果差异不大，但甲醇与流动相中的乙腈毒性较大，故提取溶剂选择70%乙醇。

3. 5 提取方法及超声时间的选择考察了分别超声处理10、20、40、90 min 与浸渍6 h 的提取效果，表明不同超声处理时间与浸渍较长时间测得结果大致相同，RSD 为0. 94%，故选择提取方式为超声10 min 列入正文。

参考文献:

［1］ 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂( 第六册)［S］. 1993.

［2］ 杨增明. HPLC 法测定淫羊藿苷含量研究［J］. 中国药品标准，2008，(1):143-146.

［3］ 顾利红，张莹. HPLC 测定护心胶囊中淫羊藿苷的含量［J］.中成药，2008，30(7):1092.

［4］ 高红梅，鞠凤霞，白冰. HPLC 测定回春胶囊中淫羊藿苷含量［J］. 中成药，2007，29(5):附14.

［5］ 中国药典［S］. 一部. 2005.