摘要:目的　研究类叶升麻苷在M PTP诱导的C57小鼠的帕金森病(PD)模型中的神经保护作用及机制。方法　通过自主活动实验和滚筒实验研究动物的行为表现, 通过高效液相电化学检测方法观察脑纹状体多巴胺的变化, 通过脑黑质酪氨酸羟化酶( ty roxine hydroxy lase, TH)免疫组化染色观察多巴胺能神经元的损伤程度。并对黑质纹状体进行α-突触核蛋白(α-synuclein)的免疫印迹分析以探讨药物作用机制。结果　①经MPTP诱导的C57 小鼠, 其自主活动次数、滚筒运动潜伏期均低于对照组(P <0.01);纹状体多巴胺含量明显降低(P <0. 01);多巴胺能神经元数量明显减少;黑质纹状体α-synuc le in蛋白水平下降。②经类叶升麻苷(10、30 m gkg- 1 )预处理后能明显改善M PTP诱导的C57小鼠的行为学表现, 增加脑内多巴胺递质的含量, 增加多巴胺能神经元的数量, 增加黑质纹状体α-synuclein蛋白水平。结论　类叶升麻苷具有神经保护作用, 能对抗MPTP诱导的C57小鼠PD模型中的神经损伤。其机制可能与上调α-synucle in蛋白水平有关。

关键词:类叶升麻苷;MPTP;PD模型;酪氨酸羟化酶;α-突触核蛋白;神经保护

　帕金森病(Park insons d isease, PD)是一种常见的神经退行性疾病, 其主要病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元的变性和坏死, 导致神经递质多巴胺的不足, 最终造成PD 特有的运动功能障碍。由于PD的病因复杂, 社会危害大, 随着高龄化社会的到来, 寻找具有抗PD功效的天然药物尤为重要。肉苁蓉(Herba Cistanches)为常用的传统补益中药, 具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。其有效成分为苯乙醇苷类化合物(pheny le thanoid glycosides,

PhG s)。本实验室前期研究工作发现苯乙醇总苷具有对抗MPTP损伤C57小鼠多巴胺能神经元保护作用[ 1] 。其总苷成分之一类叶升麻苷(ac teoside)在其中的含量达10%, 在细胞水平上抗PD细胞凋亡的作用亦得到证实[ 2, 3] , 而其在整体动物水平的抗PD作用及对家族性PD 致病相关蛋白α-synuclein的调节作用尚未见报道。α-synuc lein 也叫α-突触核蛋白, 是近年来在PD 发病研究机制中得到广泛关注的蛋白, 它与遗传性PD和散发性PD 都有密切关系, 已有的研究表明:α-synucle in 可能是PD发病的中心环节[ 4] 。观察在MPTP损伤和药物干预的情况下该蛋白的变化情况, 将有助于揭示PD的发病机制和具有保护作用的药物的作用机制。因此本实验进一步研究类叶升麻苷的神经保护作用及其可能的机制。为开发具有抗PD作用的天然药物提供初步实验依据。

1　材料与方法

1. 1　动物　C57BL /6小鼠, ♂, 体重20 ～ 25 g , 由北京大学医学部实验动物中心提供, 动物合格证号:SCXK11 - 00 - 0004。

1. 2　药品　类叶升麻苷由北京大学药学院天然药物学系屠鹏飞教授提供, 相对分子量624, 易溶于水, 纯度达到98%以上。

1. 3 　试剂　1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP), 为S igma公司产品。α-synucle in蛋白单克隆抗体由北京宣武医院于顺教授提供, 酪氨酸羟化酶( ty rox ine hydroxy lase, TH )多克隆抗体为美国Chem icon In te rnational公司产品, H istostainTM -SP K its为北京中山生物技术有限公司产品, ECL试剂为北京普利莱生物技术公司产品。

1. 4　仪器　XZ-4型小鼠自主活动仪, 由中国医学科学院药物研究所研制。SD-2型小鼠滚筒仪, 北京大学医学部实验仪器厂生产。ESA 库仑电化学检测器5600A, 美国Princeton Applied Research C orporation生产, C18柱, 迪马公司产品。

1. 5　动物模型的建立及分组给药　60只小鼠随机分5组, 每组12只, 分别为对照组、模型组、阳性药金刚烷胺组(40 mg kg -1 )、以及类叶升麻苷给药组(10, 30mg kg -1 )。连续灌胃给药14 d, 于第11天开始灌胃给药前1 h腹腔注射MPTP 30mg kg -1(对照组给予等体积的生理盐水), 连续4 d, 最后1次给药后1 d, 进行行为学指标测试, 4 d后脱颈处死, 分别取小鼠脑纹状体和黑质, 于- 80℃保存, 用于分别测定多巴胺含量以及免疫组化和W estern

blot分析。

1. 6　指标测定及方法

1. 6. 1　一般行为学观察　观察小鼠在腹腔给予MPTP造模后的一般行为表现, 有无异常反应[ 5] , 比较分析各组之间的差异。

1. 6. 2　自主活动实验　使用XZ-4型小鼠自主活动仪测定小鼠自发活动并记数, 将小鼠放入自主活动箱中(高:13 cm, 直径:25 cm, 每次同时测定4 只小鼠, 每个活动箱中1 只)由记录仪自动记录小鼠活动, 测定每只小鼠5 m in内的活动次数[ 6] , 进行统计学处理。

1. 6. 3　滚筒实验　使用SD-2型小鼠滚筒仪测试小鼠的滚筒行为表现[ 7] 。测试前连续训练3 d, 每天2次, 转速为12 r m in-1 , 训练时间120 s。将小鼠置于滚筒仪的滚筒上, 设置转速35 r m in-1 , 测试小鼠从滚筒开始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期, 测试时间为120 s。每只小鼠测3次取平均值。

1. 6. 4　高效液相-电化学法(HPLC-EC)分析　采用HPLC-EC 测定纹状体内DA 的含量。样品预处理:将小鼠脱颈处死, 取小鼠双侧纹状体置于冰浴上, 加入100 μl溶液A (0.4 mo l L-1 HC lO4 )冰浴超声匀浆处理, 4℃静置1 h, 注意避光保存。然后离心15m in(15 000 ×g, 4℃), 取上清加入40 μl溶液B(20mmol L- 1柠檬酸钠, 300 mmo l L-1K2HPO4和2mmol L- 1 Na2EDTA ), 充分混匀后4℃静置1h, 条件同上。再离心15m in(15 000 ×g, 4℃), 得到样品上清, -80℃存放备用。样品测定条件:施加电势:0 ～ 500 mV, 以100mV 递增。流动相:柠檬酸缓冲液100mmol L- 1 ,Na2EDTA 100mmol L- 1 , 八烷基硫酸钠20 mmo lL-1 , 20% 甲醇。样品预处理液:0.4 mo l L- 1HC lO4 , 200 mmo l L- 1柠檬酸甲缓冲液。C18柱流速:1 m l m in-1 , 温度24℃ ±1℃。进样量:10 ～ 20μl。多巴胺含量用μg g -1湿组织重表示。

1. 6. 5　免疫组化分析　将小鼠用戊巴比妥钠(50mg kg- 1 , ip)麻醉后, 先用生理盐水灌注, 再用4%的多聚甲醛缓冲液灌注, 取出脑组织置于4%多聚甲醛缓冲液内, 室温存放。对黑质进行石蜡切片(厚10 μm), 做TH 的免疫组化染色。使用TH多克隆抗体以及H istostainTM -SP K its试剂盒。DAB 显色观察细胞的阳性反应。显微照相的放大倍数为33倍。

1. 6. 6　W estern blo t实验　样品预处理:将小鼠断头处死, 在冰浴的培养皿上迅速分离黑质和纹状体,置于Eppendo rf管内迅速称重, 于- 80℃冰箱存放。加入匀浆缓冲液(1 g:5 m l)冰浴制备匀浆, 匀浆缓冲液为80 mmo l L-1 Tris-HC l缓冲液(pH 7.4),0.1 mmo l L-1 PMSF, 0.4 mmo l L-1 DTT, 0.1%SDS(W /V), 2mmo l L- 1 Na2EDTA。将匀浆液离心15m in(15 000 ×g , 4℃), 收集上清, 并使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度, 以保证各电泳各上样总蛋白浓度一致。得到的蛋白提取液经12.5%SDS-PAGE 变性凝胶电泳后, 以250 mA 恒流1 h进行电转移, 用5%脱脂奶粉封闭1 h。加入α-synuclein 的单克隆抗体(1 ∶1000 稀释), 4℃孵育过夜。之后, 加入辣根酶标记二抗37℃孵育1 h。ECL发光液曝光, X光片显影、定影。

1. 6. 7　统计学处理　所有数据均以–x ±s表示。除滚筒实验采用Mann-Whitney U 检验外, 其余实验的各组间比较采用单因素ANOVA 检验。

2　结果

2. 1　一般行为学　腹腔给予MPTP(30 mg kg -1 )后5 m in开始, 与对照组相比MPTP模型组小鼠的一般行为表现异常, 大多数出现下列变化:举尾、竖毛、唾液分泌增多、呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感以及牙颤等, 其持续时间一般为2 ～ 3 h。而类叶升麻苷(10、30 mg kg- 1 )和金刚烷胺(40mg kg- 1 )组, 其症状表现较轻, 持续时间较短。

2. 2　自主活动实验　实验结果表明MPTP模型组与对照组相比活动次数明显减少(P <0.01), 用10、30 mg kg -1类叶升麻苷预处理后, 和MPTP模型组相比能明显增加其活动次数(均为P <0.01, F ig1)。

2. 3　滚筒实验　实验结果表明MPTP 模型组与对照组相比, 运动潜伏期明显缩短(P <0.01), 用10、30 mg kg -1类叶升麻苷预处理后, 和MPTP模型组相比能明显的增加滚筒运动潜伏期(均为P <0.01,Fig 2)。

2. 4　HPLC实验　实验结果表明MPTP模型组与对照组相比, DA含量明显降低。给予30 mg kg -1类叶升麻苷预处理后, 能够增加纹状体内DA 的含量(P <0.01, Fig 3)。

2. 5　免疫组化实验　TH 的免疫组化染色结果如Fig 4所示, 对照组可见大量免疫染色阳性细胞, 胞质丰富, 细胞轴突清晰。模型组免疫染色阳性细胞数明显减少, 轴突断裂, 用30 mg kg-1类叶升麻苷预处理后有改善作用, TH 阳性细胞数增加(Fig 4和Tab 1)。

2. 6　Western b lot实验　给予MPTP 后可看到黑质和纹状体的α-synucle in水平明显降低, 而给予类叶升麻苷后则可以增加α-synuc le in 水平, 从而说明类叶升麻苷能够对抗MPTP诱导的多巴胺能神经元α-synuc lein的降低(Fig 5)。

3　讨论

肉苁蓉为补益中药研究的热点之一, 除作为传统的补肾壮阳中药外, 更兼具有抗衰老、增强记忆、提高免疫力等多种功能, 近20年来受到国内外的普遍关注。类叶升麻苷是肉苁蓉提取物苯乙醇苷中的单体成分, 已有研究对类叶升麻苷在PD动物模型

上抗细胞凋亡, 抗氧化损伤等方面的作用进行了探讨[ 2, 3] , 本实验从整体动物水平进一步验证其神经保护作用。MPTP 对小鼠、灵长类动物和人类多巴胺能神经元具有选择性毒性[ 8] , 是模拟环境因素导致PD 模型的经典造模剂, 因此本实验采用小鼠MPTP损伤模型研究类叶升麻苷的神经保护作用。实验结果表明, MPTP 诱发小鼠出现帕金森病症状的表现非常明显, 在行为学方面, 其肌肉震颤, 随意运动减少, 运动协调能力下降可分别从一般行为学

表现、自主活动实验、滚筒实验中得到观察。免疫组化实验通过TH阳性神经元的变化从形态学反映出多巴胺能神经元的破坏。TH 是多巴胺合成代谢中的限速酶, 通过TH 抗体染色, 可以明显观察到多巴胺能神经元的变化。HPLC-EC 实验则从多巴胺神经递质的含量变化(直接反映多巴胺能神经元功能的物质基础)表明动物黑质-纹状体多巴胺能神经元功能的减弱, 上述结果表明PD 小鼠模型的建立是成功的。在此基础上, 预先给予类叶升麻苷, 并在

MPTP损伤过程中继续给药处理后的动物组, 与模型组比, 其一般行为学表现显示中毒症状减轻, 自主活动能力增强, 运动协调能力改善, 多巴胺能神经元数量增多, 脑纹状体中多巴胺含量明显增加, 表现出对抗MPTP损伤的作用。本研究参照细胞水平的实验设计(用类叶升麻苷预处理细胞, 对PD 细胞模型具有保护作用)[ 3] , 以预防性给药方式, 在造模前和造模中连续给药, 实验结果反映了类叶升麻苷在整体动物水平具有预防PD的作用。

已有研究表明, 将小鼠α-synuclein基因敲除后可抵制MPTP引起的神经毒性作用[ 4] 。α-synucle in在脑内的基因突变和异常代谢参与了PD 等神经系统退行性疾病的发生, 其在PD 等神经系统退行性疾病发生过程中的作用机制已成为目前研究的焦点[ 9 -12] 。

因此, 本实验观察在MPTP损伤的小鼠, 其黑质纹状体通路多巴胺能神经元α-synuclein蛋白水平如何变化, 而类叶升麻苷对这种改变又会产生什么影响, 这既有利于探讨药物作用机制, 又为PD 病因的研究提供参考。本文采用亚急性给予MPTP 造模, Weste rn blo t结果显示黑质纹状体α-synuclein蛋白水平降低, 免疫组化实验表明黑质α-synuclein蛋白和TH 蛋白免疫反应阳性细胞数减少(α-synucle in的免疫组化结果未提供), 显示这二者在蛋白质水平均呈下降趋势, 与Xu等[ 13] 的结果相似。而预先给予类叶升麻苷后则可对抗这种改变。提示一种可能的机制是类叶升麻苷具有对抗MPTP的细胞保护作用, 从而减轻了MPTP对细胞的氧自由基损伤, 本室已有研究发现类叶升麻苷可明显抑制鱼藤酮诱导的自由基生成[ 3] 。另外, 类叶升麻苷的神经保护作用还可能与上调α-synuclein蛋白水平有关, 其详细的作用机制有待进一步探讨。

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