摘要：目的　观察类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用。方法　采用卡介苗（ＢＣＧ）联合脂多糖（ＬＰＳ）建立大鼠原代肝细胞免疫性损伤模型，测定并比较各组肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶（ＡＬＴ）、谷草转氨酶（ＡＳＴ）的活性和一氧化氮（ＮＯ）在不同培养时间点（３，６，１２和２４ｈ）的含量。结果　与模型组相比较，类叶升麻苷在不同时间点均能明显降低ＡＬＴ、ＡＳＴ和ＮＯ水平（Ｐ＜０．０１），且呈剂量依赖关系。结论　类叶升麻苷对卡介苗联合脂多糖诱导的大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤具有保护作用。

关键词：类叶升麻苷；肝细胞；免疫性肝损伤；肝保护作用

苯乙醇苷类（ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）含有羟基、甲氧基取代苯乙基及羟基、甲氧基取代肉桂酰基，通常是以β－葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷类化合物，具有抗氧化、抗菌抗炎和免疫调节等多种药理作用［１］。近年来还发现，该类化合物具有较强的肝保护作用。类叶升麻苷（ａｃｔｅｏｓｉｄｅ）是此类成分中最有代表性的化合物，是多种复方及单方中药民族药所含的主要标志性成分，广泛分布于肉苁蓉和列当等生长于干旱、半干旱地区的植物中［２－３］。为了进一步开发类叶升麻苷，拓展其应用，笔者以临床常用的保肝降酶药联苯双酯（ＤＤＢ）作为阳性对照，采用卡介苗（ＢＣＧ）联合脂多糖（ＬＰＳ）诱导的原代肝细胞损伤模型，在体外研究类叶升麻苷的肝保护作用。

１　仪器与材料

１．１　仪器　Ｂｅｃｋｍａｎ　７００全自动生化分析仪（Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；ＣＯ２恒温培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｏｒｍａ公司）；ＨＬ－２型恒流泵（上海精科实业有限公司）；ＴＤＬ８０－２Ｂ台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；ＢＯＸＵＮ洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；ＺＰＸ－３５ＢＩ座式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

１．２　试药　类叶升麻苷（自制，质量分数＞９５％）；联苯双酯滴丸（ＤＤＢ，德州德药制药有限公司，批号０６０４１０）；Ⅳ型胶原酶、脂多糖ＬＰＳ（Ｅ　ｃｏｌｉ　０５５５：Ｂ５，Ｓｉｇｍａ公司）；高糖ＤＭＥＭ培养基（ＧＩＢＣＯ公司）；无噬菌体低内毒素胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号０６１２０５）；卡介苗（ＢＣＧ，上海生物制品检定所，５０ｍｇ／支）；谷草转氨酶（ＡＳＴ）和谷丙转氨酶

（ＡＬＴ）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；Ｎ－萘基－乙烯二胺和对氨基苯磺酰胺（Ｆｌｕｋａ公司）。

１．３　实验动物　雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠（１８０～２２０ｇ）购自新疆医科大学实验动物中心，动物使用许可证号ＳＹＸＫ［新］２００３－０００１。

２　方法

２．１　大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤模型的制备　雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠１０只，随机分为正常对照组和模型组，模型鼠经尾静脉注射ＢＣＧ　８ｍｇ／只（约５×１０７个活菌数）致敏，正常对照组经尾静脉注射同体积生理盐水。实验第１２ｄ后分别取正常和ＢＣＧ致敏的大鼠，按文献报道方法［４］采用两步灌流法分离获取大鼠原代肝细胞：用３ｇ·Ｌ－１的戊巴比妥钠０．５ｍＬ麻醉后，手术分离肝门静脉并行门静脉插管，以３７℃恒温氧饱和的无钙灌流液５００ｍＬ灌流肝脏（流速２０ｍＬ·ｍｉｎ－１），并迅速剪断下腔静脉，作在位灌流５ｍｉｎ，边灌流边切断肝与周围组织的联系，３７℃恒温氧饱和的０．２５ｇ·Ｌ－１Ⅳ型胶原酶灌流液循环灌流１０ｍｉｎ，然后经门静脉插管推注４ ℃高糖ＤＭＥＭ培养液２０ｍＬ封闭消化。取出肝脏放入盛有３０ｍＬ含４℃高糖ＤＭＥＭ培养液的平皿中，用高糖ＤＭＥＭ培养液清洗２次，散落肝细胞，用１００目

筛网过滤，收集细胞悬液，５００ｒ·ｍｉｎ－１离心３ｍｉｎ，弃上清液，向沉淀中加入高糖ＤＭＥＭ培养液轻轻吹打均匀，同条件重复离心２次。用４ｇ·Ｌ－１等张台盼蓝溶液染色，光镜下计数细胞产量与活率，细胞活

率在９５％以上的肝细胞用于进一步实验。

２．２　细胞活性实验　设正常对照组、模型组（ＢＣＧ＋ＬＰＳ）、溶剂对照组（ＢＣＧ＋ＬＰＳ＋ＤＭＳＯ）、类叶升麻苷（５，２０和８０μｇ·ｍＬ－１）组和ＤＤＢ（５，１０和２０μｇ·ｍＬ－１）组。取正常和ＢＣＧ致敏的大鼠肝细胞悬液用高糖ＤＭＥＭ培养液稀释成２．５×１０５细胞·ｍＬ－１，接种于２４孔培养板中，每孔１．０ｍＬ。继续培养１６ｈ后，ＢＣＧ致敏大鼠的肝细胞用１０μｇ·ｍＬ－１的ＬＰＳ攻击，造成肝损伤细胞模型，同时分别加入以不含血清的高糖ＤＭＥＭ培养液配制的各质量浓度样品溶液１．０ｍＬ，继续培养。分别于３，６，１２和２４ｈ收集细胞上清液，置－７０ ℃冰箱保存，待测。细胞上清液ＡＳＴ和ＡＬＴ活性测定按照试剂盒说明书测定，ＮＯ含量采用Ｇｒｉｅｓｓ法测定。

２．３　数据处理与统计分析　实验结果用珚ｘ±ｓ表示，使用ＳＰＳＳ１２．０软件包进行方差分析。

３　结果

　　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＡＳＴ、ＡＬＴ活性及ＮＯ含量的影响见图１～３。

３．１　对ＡＳＴ和ＡＬＴ活性的影响　ＢＣＧ联合ＬＰＳ造成大鼠原代肝细胞损伤后，其肝细胞培养上清液中的ＡＳＴ和ＡＬＴ水平明显高于正常组，且随时间的延长逐步升高。类叶升麻苷各剂量组在３ｈ均能显著降低ＡＬＴ，高剂量组在３ｈ可显著降低ＡＳＴ，并与低剂量组间存在显著差异（Ｐ＜０．０１），在６，１２和２４ｈ均可使升高的ＡＳＴ和ＡＬＴ明显下降，且呈剂量依赖关系。此外从图１和图２中还可看出，中、低剂量类叶升麻苷的活性与等剂量ＤＤＢ的活性相似。

３．２　对ＮＯ含量的影响　与正常组相比较，模型组大鼠肝细胞上清液ＮＯ的含量随时间的延长而逐步升高，在１２ｈ达到最高水平（Ｐ＜０．０１）。阳性对照药物ＤＤＢ，除３ｈ低剂量组外，在各时间点均可显著降低ＮＯ含量，且６，１２和２４ｈ各剂量组间存在显著的剂量反应关系（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。类叶升麻苷各剂量组在６，１２和２４ｈ均可不同程度地使升高的ＮＯ含量下降（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。此外，在药物干预３ｈ时，类叶升麻苷的高剂量组可显著降低ＮＯ含量，并与低剂量组间存在统计学意义（Ｐ＜０．０１）。

图１　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＡＳＴ水平的影响

注：与空白对照组相比较ａ）Ｐ＜０．０１；与模型组相比较ｂ）Ｐ＜０．０１；与同组低剂量组相比较ｃ）Ｐ＜０．０１，ｄ）Ｐ＜０．０５

图２　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＡＬＴ水平的影响

注：与空白对照组相比较ａ）Ｐ＜０．０１；与模型组相比较ｂ）Ｐ＜０．０１，ｃ）Ｐ＜０．０５；与同组低剂量组相比较ｄ）Ｐ＜０．０１，ｅ）Ｐ＜０．０５

图３　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＮＯ水平的影响

注：与空白对照组相比较ａ）Ｐ＜０．０１；与模型组相比较ｂ）Ｐ＜０．０１，ｃ）Ｐ＜０．０５；与低剂量组相比较ｄ）Ｐ＜０．０１，ｅ）Ｐ＜０．０５

４　讨论

　　近年来，采用ＢＣＧ联合ＬＰＳ诱导大鼠原代肝细胞产生免疫性肝损伤模型已成为筛选和研究抗肝炎药物的常用方法之一。该模型的损伤机制为ＢＣＧ首先激活致敏Ｔ淋巴细胞，尤其是致敏肝内枯否氏细胞和巨噬细胞，并大量聚集于肝脏。当用ＬＰＳ进一步刺激激活处于致敏状态的巨噬细胞后，大量细胞毒性因子被释放出来，如一氧化氮（ＮＯ）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）和白细胞介素等，造成肝细胞损害［５］。肝脏是富含酶的脏器，在肝内ＡＬＴ和ＡＳＴ主要分布于细胞浆和线粒体中。在肝脏组织受损时，酶从细胞内逸出进入血液，致使血清中ＡＬＴ和ＡＳＴ增高。因此，肝组织ＡＳＴ、ＡＬＴ活性下降及血清ＡＳＴ、ＡＬＴ活性升高为肝功能受损的特异性指标。本实验结果显示，类叶升麻苷在６，１２和２４ｈ均可不同程度地使升高的ＡＳＴ和ＡＬＴ活性降低，说明该成分对免疫性肝损伤具有较好的降酶作用，且与阳性对照药物ＤＤＢ的作用类似。作为一种自由基，ＮＯ的过度产生也可直接导致机体正常组织的损伤。肝巨噬细胞可通过释放ＮＯ对肝细胞产生毒性，且肝细胞在体外也可经特异性细胞因子及ＬＰＳ协同诱导，持续产生大量的ＮＯ，介导多种病理生理效应，包括肝细胞毒性效应［６］。类叶升麻苷在不同的时间点均可使升高的ＮＯ水平降低，且这种作用呈一定的浓度依赖关系。此结果提示类叶升麻苷可能通过抑制肝细胞释放ＮＯ的通路，降低肝细胞受损伤程度，进而抑制ＡＳＴ和ＡＬＴ的活性，显示出较好的保肝降酶作用。

参考文献：

［１］　靖会，佐建锋，李教社．苯乙醇苷类化合物的药理研究进展［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，１７（３）：４４０－４４１．

［２］　宋志宏，莫少红，陈燕，等．德赢vwin登录 化学成分的研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０００，２５（１２）：７２８－７３０．

［３］　赵军，闫明，黄毅，等．紫花列当水溶性成分的研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００９，２１：６１９－６２１．

［４］　郑芹珠，王立明，楼宜嘉．卡介苗联合脂多糖诱发大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤模型的构建［Ｊ］．浙江大学学报：医学版，２００２，３１（６），４１９－４２５．

［５］　Ｚｈａｎｇ　ＧＬ，Ｗａｎｇ　ＹＨ，Ｎｉ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｒｏｌｅｏｆ　ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ＢＣＧ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００２，８（４），７２８－７３３．

［６］　章国良，林志彬．细胞因子对内毒素刺激的原代培养大鼠细胞一氧化氮生成的影响［Ｊ］．北京医科大学学报，１９９８，３０（８）：１８０－１８３