摘要:目的　研究类叶升麻苷抗鱼藤酮致多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞损伤, 对帕金森病相关蛋白Parkin、α-突触核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)表达的影响, 探讨类叶升麻苷抗细胞损伤的分子机制。方法　化学比色法测定细胞培养液乳酸脱氢酶( lactate dehydrogena se, LDH)活性, 蛋白质印迹法(W este rn b lo t)检测Park in、α-Syn的表达, 免疫荧光法检测SH-SY5Y细胞α-Syn分布。结果　①类叶升麻苷(10, 20 或40 mg L- 1)可明显降低鱼藤酮诱导的SH-SY5Y 细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放;② 0.5 μmo l L- 1的鱼藤酮处理SHSY5Y细胞48 h能引起Pa rkin蛋白的明显降解及α-Syn蛋白二聚体增加;③预先用类叶升麻苷(10, 20或40 mg L- 1)处理细胞, 能够有效减少鱼藤酮诱导的Park in蛋白的降解, 呈浓度依赖性;并能够抑制鱼藤酮诱导的α-Syn蛋白二聚体增加及α-Syn阳性细胞数增加。结论　类叶升麻苷对鱼藤酮致SH-SY5Y细胞损伤具有神经保护作用, 其作用机制可能与减少Park in蛋白的降解和抑制α-Syn蛋白的二聚体形成有关。

关键词:类叶升麻苷;鱼藤酮;SH-SY5Y 细胞;乳酸脱氢酶;Park in;α-突触核蛋白

　帕金森病(Parkinson disease, PD)是一种以黑质纹状体通路的退变为主要特征的神经系统变性疾病。PD的基本病理特征是黑质致密区多巴胺神经元变性伴胞质内嗜酸性包涵体即路易(Lew y)小体形成, 导致黑质纹状体通路破坏及尾状核、壳核中神经递质多巴胺含量减少[ 1] 。PD 的发病机制尚未明确, 与遗传、环境因素、氧化应激、过多的自由基形成及神经生长因子缺乏等有关[ 2] 。目前关于PD 的发病机制研究越来越集中在与PD相关的基因及蛋白的分子机制研究, 已发现有数种基因及其蛋白和PD相关[ 3] , 如Parkin蛋白和α-突触核蛋白(α-Synuc lein,α-Syn)。Park in 蛋白是一种E3 泛素蛋白连接酶, Park in蛋白在PD发病机制中具有保护多巴胺神经元的功能, 如Park in蛋白可减少红藻岩酸诱导的细胞凋亡[ 4] 。利用免疫组化法发现PD 患者脑中特征的路易小体及路易神经轴束(Lewy neurite)中存在大量的α-Syn蛋白, 尽管这些患者并不存在该基因的突变。同时, Feany 等[ 5] 在将人野生型和突变型α-Syn基因转入果蝇后, 发现这些果蝇不但出现运动行为障碍, 而且有多巴胺能神经元选择性变性和死亡, 同时部分神经元中出现类似于路易小体的包涵体。这些结果证实α-Syn蛋白在神经变性死亡中起关键作用。有关类叶升麻苷(acteoside)对鱼藤酮致SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用已有报道[ 6] , 但其对该细胞模型保护作用的分子机制研究尚未见国内外报道。因此本文用鱼藤酮诱导建立SH-SY5Y细胞损伤模型, 首次就类叶升麻苷的神经保护作用

同Park in及α-Syn蛋白表达水平之间的关系进行了探讨。

1　材料与方法

1. 1　材料

1. 1. 1　试剂　鱼藤酮(ro tenone)、胰蛋白酶(trypsin)为S igma 公司产品;1640 培养基、胎牛血清为G ibco公司产品;乙二胺二乙酸二钠盐(EDTA-Na2 )为Am re sco公司产品;小鼠神经生长因子(mNGF)、蛋白提取试剂盒为Promega公司产品;蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品;兔抗人Park in多克隆抗体、兔抗人α-Syn 多克隆抗体为Ce ll signaling 公司产品;二抗和ECL试剂盒均为Santa cruz公司产品。鱼藤酮溶解于二甲基亚砜(DMSO, S igma)中, 配成1mmo l L- 1储存液于常温避光备用。类叶升麻苷相对分子量为624, 经HPLC 检测纯度>98%, 由北京大学药学院天然药物学系屠鹏飞教授提供。人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)购自中国医学科学院细胞库。

1. 1. 2　主要仪器　CO2 孵箱:SANYO 公司;倒置相差显微镜:德国LE ICA公司;倒置荧光显微镜:日本OLMPUS公司;Im age Master VDS 凝胶成像分析系统:B io Rad公司;全自动生化分析仪:AMS公司。

1. 2　方法

1. 2. 1　SH-SY5Y细胞培养　1640培养基加体积分数为0.1的胎牛血清、青霉素1 ×105 U L-1 、庆大霉素8 ×104 U L-1 , 5% CO2 , 37℃培养细胞。待细胞增长至70%融合时, 用含0.1 g L-1 EDTA-N a2的0.5 g L-1胰蛋白酶消化传代, 1 ∶3分瓶传代,每4天传代1次。当细胞用药物(类叶升麻苷、鱼藤酮或NGF)处理时, 换用含体积分数为0.01的胎牛血清的培养基进行培养, 细胞每隔2天换液1次。

1. 2. 2　实验分组和药物处理　SH-SY5Y 细胞分为以下各组:①正常对照组:除了含体积分数为5 ×10- 3 DMSO 外, 不加其他任何药物;②类叶升麻苷单独处理组:除了含类叶升麻苷(20 mg L- 1 )外, 不加其他任何药物;③细胞损伤组:培养液中加入0.5μmo l L-1鱼藤酮;④类叶升麻苷组:用不同终浓度(10、20、40 mg L- 1 )类叶升麻苷预处理6 h +0.5μmo l L-1鱼藤酮;⑤阳性对照组:小鼠神经生长因子(NGF, 200 μg L-1 )预处理6 h + 0.5 μmo lL-1鱼藤酮, 7组细胞培养所需时间后, 进行指标测定。

1. 2. 3　细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH )水平的测定　用1 ×108 L-1的细胞悬液接种24孔板, 每孔400 μl。培养方法同前。收集各孔培养上清液,用全自动生化分析仪测定LDH活性。

1. 2. 4　W este rn-blo t检测Parkin、α-Syn的表达　低温提取细胞蛋白, BCA 法测定蛋白浓度。每孔的上样量为50 μg, 质量体积分数为0.125的SDS-PAGE分离样品。转膜, 封闭, 将膜与溶于封闭液中的一抗(兔抗人Parkin多克隆抗体1 ∶1 000, 兔抗人α-Syn多克隆抗体1 ∶1 000)4℃孵育过夜, 漂洗, 将膜浸入以1 ∶5 000体积比稀释(用封闭液)的二抗稀释液, 室温孵育2 h, 加入ECL试剂, 曝光, 显影, 定影,对X 光底片拍照, 并用VDS凝胶成像系统分析软件

进行光密度积分值分析。

1. 2. 5　间接免疫荧光法检测SH-SY5Y 细胞α-Syn的分布　将盖玻片(8 mm ×8 mm )置于6 孔板中,以1 ×105 个/孔 将SH-SY5Y 细胞悬液接种于6 孔培养板的盖玻片上, 37℃, 5% CO2 , 孵育一定时间,待细胞基本贴壁后, 分为3组, 分别为正常对照组、细胞损伤组和类叶升麻苷组(20 mg L- 1 )。其余处理步骤同前, 造模24 h后用PBS 漂洗3次, 4℃4%甲醛固定15 m in, PBS 漂洗3次, 37℃ 5%胎牛血清封闭30m in, PBS漂洗3次, 滴加一抗(小鼠α-Syn单抗1 ∶50), 将6孔板制成湿盒, 37℃孵育2 h,PBS漂洗3次, 滴加荧光素标记二抗(1 ∶50), 37℃孵育1 h, PBS漂洗3次, 荧光显微镜下观察并拍照。

2　结果

2. 1　类叶升麻苷对LDH 活性的影响　鱼藤酮(0.5 μmol L- 1 )诱导SH-SY5Y 细胞损伤24 h后,细胞损伤组LDH值较正常对照组明显升高;类叶升麻苷组(10、20、40mg L-1 )抑制LDH 活性呈浓度依赖性, 结果表明类叶升麻苷浓度越高, 对SHSY5Y细胞保护作用越强。鱼藤酮诱导48 h, 各组的LDH 变化同24 h时间点类似, 具有浓度依赖关系, 但细胞损伤组LDH 值较正常对照组升高更加明显, 并观察到更加明显的类叶升麻苷神经保护作用(Tab 1)。

2. 2　类叶升麻苷对鱼藤酮致Parkin蛋白降解的影响

2. 2. 1　W estern blot量效实验　细胞损伤组的Parkin蛋白的38 ku 降解条带较正常对照组和类叶升麻苷单独处理组条带较粗, 灰度值较高, 而类叶升麻苷组(10、20、40mg L-1 )及阳性对照组(NGF, 200μg L- 1 )与细胞损伤组比较, 38 ku降解条带较细,灰度值较低, 其中类叶升麻苷组(40 mg L-1 )的38ku降解条带最细, 灰度值最低。该结果表明类叶升麻苷可能通过抑制Park in 蛋白的降解而发挥其对损伤神经细胞的保护作用, 其中类叶升麻苷组(40

mg L-1 )抑制Parkin 蛋白降解作用最明显(F ig1)。

2. 2. 2　W estern blo t时效实验　细胞损伤组(鱼藤酮作用48 h)的Parkin蛋白的38 ku 降解条带较正常对照组条带较粗, 灰度值较高, 而类叶升麻苷组(鱼藤酮作用24、48、72 h)与细胞损伤组比较, 38 ku降解条带变细, 灰度值降低。且在鱼藤酮诱导48 h时, 降解条带最细, 灰度值降低最明显。该结果表明类叶升麻苷抑制Pa rkin蛋白的降解作用同鱼藤酮作用时间相关(Fig 2)。

2. 3　类叶升麻苷对鱼藤酮致α-Syn蛋白表达的影响

2. 3. 1　W este rn b lo t实验　细胞损伤组的α-Syn蛋白的36 ku二聚体较正常对照组和类叶升麻苷组单独处理组条带较粗, 灰度值高, 而类叶升麻苷组(10、20、40 mg L-1 )及阳性对照组(NGF, 200 μgL- 1 )与细胞损伤组比较, 36 ku二聚体条带较细,灰度值降低, 但浓度关系不明显。该结果表明类叶升麻苷可能通过影响α-Syn蛋白的聚集发挥其对损伤神经细胞的保护作用(Fig 3)。

2. 3. 2　免疫荧光实验　采用α-Syn抗体进行间接免疫荧光检测, 观察到细胞损伤组较正常对照组荧光强度增强, 而类叶升麻苷组(20 mg L- 1 )与细胞损伤组比较, 荧光强度减弱, 类叶升麻苷(20 mgL-1 )能够抑制鱼藤酮引起的α-Syn 阳性细胞数增多。该结果表明类叶升麻苷(20 mg L- 1 )的神经保护作用与抑制α-Syn蛋白表达相关(F ig 4)。

3　讨论

盐生肉苁蓉[ 6] 为列当科肉苁蓉属多年生寄生草本植物, 分布于我国西北各省区。类叶升麻苷属于苯乙醇苷类[ 7] , 是盐生肉苁蓉的有效成分之一。Sheng等[ 8]研究发现类叶升麻苷具有抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子( 1-me thy l-4-pheny lpyri-dinium,MPP+ )致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞凋亡、线粒体损伤和氧化应激的作用。杨芳艳等[ 6]发现类叶升麻苷对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有明显的保护作用, 并可明显抑制鱼藤酮所诱

导的自由基生成。而关于类叶升麻苷抗神经细胞损伤机制与Parkin及α-Syn蛋白表达的关系尚未见报道。

LDH水平的升高是细胞受损的一个敏感指标,细胞释放LDH增加, 通常反映细胞损伤、细胞膜通透性增加。本研究发现, 鱼藤酮(0.5 μmo l L-1 )诱导细胞损伤24 h和48 h后, SH-SY5Y 细胞培养液中LDH活性较正常对照组明显升高, 类叶升麻苷低、中、高浓度组均可抑制鱼藤酮所致SH-SY5Y细胞LDH 的释放, 提示类叶升麻苷对鱼藤酮致SHSY5Y细胞损伤具有神经保护作用, 且随浓度增加保护作用增强。鱼藤酮诱导细胞损伤48 h后, 可观察到类叶升麻苷的神经保护作用更加明显。Parkin是隐性遗传性少年型帕金森病的致病基因[ 9] , Parkin是Park in致病基因表达的蛋白, Park in蛋白分子量为52 ku。Parkin的功能发挥有赖于结构的完整, 结构完整的Parkin蛋白能有效清除具有细胞毒性的底物, 从而保护细胞, 避免损伤的发生和发展, Park in 蛋白可抑制未折叠蛋白(如:αSp22、Pael-R)应激引起的细胞死亡[ 10] , Parkin的表达可以抵制蛋白酶抑制剂引起的损伤[ 11] 。本研究首次探讨了类叶升麻苷的作用同Park in 蛋白表达变化的关系, 研究发现类叶升麻苷可通过有效减少Park in蛋白的降解, 对神经细胞呈现保护作用。α-Syn是隐性遗传性帕金森病的致病基因, α-Syn是该基因表达的蛋白, 分子量为18 ku, 大多分布在神经元突触前膜和核膜上。PD 发病中, α-Syn异常积聚可破坏多巴胺存储与释放, 直接抑制线粒体功能, 增加氧化应激水平, 并可参与路易体的形成过程, 因此认为它在散发性帕金森病的致病过程中

也可能起重要作用。本研究首次探讨了类叶升麻苷的作用同α-Syn蛋白表达变化的关系, 研究发现类叶升麻苷可通过抑制鱼藤酮引起的α-Syn蛋白的聚集和抑制α-Syn阳性细胞数增加而发挥其神经保护作用。α-Syn与Parkin介导泛素-蛋白酶体的降解通路[ 12, 13] , 类叶升麻苷对神经细胞的保护作用可能同该通路相关。本研究采用Park in 及α-Syn 蛋白作为研究靶点, 从分子水平对类叶升麻苷抗PD 作用进行了研究, 从而为进一步研究抗PD 药物提供了研究思路,有利于阐明抗PD药物的作用机制。

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