王新源 王晓雯 王雪飞 蒋晓燕 帕尔哈提

【摘要】目的 探讨肉苁蓉总苷（GCx）对 D半乳糖（Dya）脑老化模型小鼠的保护作用机制。方法实验分 30d和50d每期NH小鼠各为120只，随机分为6组：正常对照组（NC）．模型组（Dgal）、Vim nE组、GC组，分小、中、大剂量组［（mgkg．d）31.25,62 5,125］，每组20只。除NC组外，在各组小鼠皮下注射Dgal（50mgkgd）NC组皮下注射 NS Dya组和NC组给于等容积饮水灌胃，ViamiE组和GC＊组灌胃给药，每日1次，均连续皮下注射和灌胃30d和504，分别测定5mn错误次数、潜伏期、脑组织SOD的活性、MDA、LF含量，并观察S0d后海马CA1区组织结构形态的变化。

结果（1）5mm内的错误次数：30d和50d的Dgal组分别为（＆25±4.03）次和（963±618）次，均显著高于其它各组（均＜0.01）。

（2）潜伏期：30d和504的D-ga1组分别为（25.21±13.86）-和（31.75±17.77），低于NC组．GCs中剂量组和大剂量组（P＜0.05．P＜0.01）。

（3）SOD活性：30d和50d D-gal组脑组织的 SOD活性较其它各组低（p0.05，p＜0.01）。

（4）MDA含量，304和50dDy组脑组织的MDA含量均较其它各组高（P＜0 05P＜0.01）。

（5）LF含量，30d和50dD-gal组脑组织的LF含量均较NC组高，30d的脑组织GC小剂量组、VimE组及 50d GCs各组及VitmE组均较D-p组低（P＜0.05P＜0 01）。

（6）50d的 D-gal组小鼠海马CA1区与NC组，GC．大剂量组及VitmE组的组织形态不同，结论 GC，能显著改善不同天数模型小鼠的学习、记忆功能，升高脑组织的SOD活性，降低MDA，IF含量，并对海马CA1区组织结构形态学改变有保护作用。提示GC＊可能是通过抗氧化的机制达到改善脑老化的作用。

   病理表现是神经突触减少，神经元纤维缠结形成巴。D半乳糖（D-gl）衰老模型是由我国学者首次提出（），此模型是一种从自由基角度反映老年痴呆模型。肉苁蓉总苷（Glcosiles of cistanche GCs）对小鼠组织具有抗氧化作用及显著降低组织中的脂褐素含量：增强机体免疫力，延缓衰老等作用。能有效地清除各种活性氧自由基，保护OH·引发的 DNA氧化损伤。为了探讨GCs对脑老化的保护作用，本研究观察GCs对30d和50d后的 Dgal脑老化模型小鼠的学习记忆功能、生化指标及海马组织结构变化的影响，并阐明GCs可能的作用机制。

材料与方法

一、实验动物及分组

1．实验动物：健康NH小鼠，体质量（18±2）g雌雄兼用，由新疆医科大学动物室提供。实验分 30d和50d每期小鼠各为120只，均应用随机数字表，将小鼠随机分为6组：正常对照组（NC）、模型组（Dgal）、维生素E组［以下简称 VitamnE组（Dal＋ViamnE50mg kg＇．d＇）］，GCs（Dgal＋GCs）分小、中、大剂量组［（mg kg-d）31． 25、62 5、125］，每组20只。对入组小鼠的饲养和给药方法及环境条件进行严格的控制。

2．药品、试剂和仪器：GCs由新疆医科大学药学系植物化学室按日本文献（公开特许公报（A）昭63-198627）上的提取方法，从北疆产盐生肉苁蓉（Cistanche sale（C A Mey）G.Beck）中提取，主要成分为苯乙醇苷类。ViamnE由上海建安制药厂生产。D由上海恒信化学有限公司生产。考马斯亮兰（Comask Brilliant Bhe CBB）G250为Fhka公司产 品。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。

二、方法

1．动物模型制备：除NC组外，在各组小鼠背部及头，颈交界处，采用皮下注射Dgal（50mg·kg＇·d）：NC组皮下注射生理盐水（10ml·kg＇·d＇）Da组和NC组给子等容积饮水灌胃，VitamiE组和GC-组灌胃给药，每日1次，均连续皮下注射和灌胃30d和50d，各组小鼠每周称重1次，并按此调整剂量。

2．跳台法学习记忆实验：见参考文献［7］。

3．脑组织 SOD活性、丙二醛（MDA）、脂褐素（LF）含量测定：饲养30d和50d各组小鼠于末次给药后4h脱颈椎处死，立即取出脑组织，用冷冻生理盐水冲洗，组织称重，各取02g制备成10％的组织浆液，3000xg高心，3mb取上清液备测，技试剂拿方法mcP鼎组脑海号。CA1区神经细胞数曩较NC组无明晃减net测SOD活性：TBA显色法测组织MDA含量：蛋白定量用CBB-SDS法。

4．光镜观察小鼠海马样品制备：饲养50d的各组小鼠将其麻醉暴露心脏，用5号针头在心尖搏动处刺入，剪开右心耳，先用30～60m109％生理盐水灌注冲洗，再用10％甲醛 30～60ml灌注，以四肢僵硬为标准，开颅取全脑，放入10％甲醛液浸泡 2b取海马，连续冠状切片，进行HE染色，光镜下观察。

5．统计学处理：采用 SPSS9 0版统计软件进行单因素方差分析，均数的两两比较采用LSD（方差具有齐性时）或 Tamhane＇sT法（方差不具有齐性时）。

结果

一、GC-各组、VitminE组及 Dgal组和NC组的潜伏期和5mm内错误次数比较（表1）

由表1显示：24h后测验时，Dgal组的5mn内错误次数较其它各组高：D-gal组潜伏期较 NC组、GCs中、大剂量组和50d的 VitminE组低（P＜0 05．P＜0.01)。

表1 肉苁蓉总苷各组与维生素 E组及模型组的潜伏期 和5mn内错误次数比较（士。）

注，LSD或Tanhase＇T法检验：与NC组比较：＃p＜0.05＃＃p＜0-0L与Dm咀比较：＊P＜D．06：＊·p＜0.01

二、GCs各组，VitmanE组及 D-gal组和NC组的脑组织 SOD活性、MDA，LF含量的比较（表2）

由表2显示：30d和50d后的脑组织 Dgal组的SOD活性较其它各组低（P＜0 05P＜0 01）：30d和50dD-gl组脑组织的MDA含量均较其它各组高；30d和50dD-gal组脑组织的LF含量均较 NC组高，30d的脑组织GCs小剂量组、VimiE组及 50d GCs各组及 VimiE组均较 D-gal组低（P＜0.05．P＜0.01)。

三、50d后NC组、Dgal组和GCs大剂量组及 VrkminE组的脑海马 CA1区组织结构变化比较

高倍镜下观察（x400）：NC组的脑海马 CAI区神经细胞数量无明显减少，无胞体皱缩，呈椭圆形，细胞核、膜界限清晰，细胞大小正常：Dgal组脑海马 CA1区神经细胞数量较NC组明显减少，分布较稀疏，细胞皱缩，细胞体积变小，呈梭状，染色深，核染色质凝聚，核膜厚，胞浆界限不清，可见凋亡小体即细胞小，胞浆红染-染色质凝聚成块，残片形成凋亡小体。GCs大剂少，细胞体呈椭圆形，部分胞体轻度皱缩，无明显变小，细胞核、膜界限清晰。VitmiE组脑海马 CA1区神经细胞数量较NC组有所减少，细胞体呈不规则椭圆形。部分胞体轻度皱缩，无明显变小，细胞核、膜界限清晰

表2 肉苁蓉总苷各组与维生素E组及模型组的脑组织 SOD活性、MDA、LF含量的比较（x±s）

注，LSD或 Tanhane T法检验：Na亚硝酸盐单位：mgpmt为毫克蛋白数：SDD为超氧化物歧化酶：MDA为丙二醛：LF为脂揭素：与NC组比较；＃P＜0.05＃p＜00L与Dp组比较：＊p＜005＊＊p＜0.01

讨 论

多种动物给予 D半乳糖导致衰老，许多研究证明，该模型动物多种细胞的病理变化也符合自然衰老时出现的症状，并用作抗衰老药物的研究（，D半乳糖可在体内氧化产生自由基，当超过机体的清除能力时，可引起脂质过氧化作用的链式反应，导致细胞膜损伤。自由基可作用于细胞膜，攻击膜磷脂质中的不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物，使膜的结构功能遭到破坏，通透性增加，膜结合酶、受体及离子通道等功能丧失，钙离子可大量进入细胞及线粒体，激活钙敏蛋白酶和磷脂酶，破坏膜性结构。当细胞内的钙离子持续升高，并同时有自由基时，会出现恶性前馈（6ed-fowanl），即钙离子加速自由基的生成，或反过来，自由基加胞内钙离子的堆积，进一步加重脑组织的损伤。促进衰老进程。

SOD是清除自由基最有效酶之一，其活性增高，间接证明组织清除自由基能力增强；MDA是自由基损伤不饱和脂肪酸生成的脂类过氧化分解产物，MDA降低可间接证明组织中自由基水平降低。有研究表明。MDA可引起精神行为改变，并通过交联、结合形成脂褐质（LF）引起神经系统功能障碍（叫）。LF是自由基氧化作用的产物，其在组织内含量与脂质过氧化反应呈正相关。LF主要积聚在大脑皮层和海马部位，其过多会破坏磷脂膜结构，导致线粒体和粗面内质网的减少，从而神经元的数目随之减少，这势必会引起脑功能的衰退。

实验结果发现：30d和50d后的模型小鼠5mm内的错误次数明显高于其它各组，潜伏期低于GCs中、大剂量组、NC组及50d后的VitamnE组，提示：GCs和VitaninE可改善脑老化模型小鼠的学习，记忆功能，以中、大剂量的作用较明显。观察GCs对模型小鼠不同天数的生化指标可以发现：30d和50d后其脑组织的SOD活性低于其它各组，MDA的含量高于其它各组：30d模型小鼠脑组织的LF含量高于NC组、VitminE组和GCs小剂量组，50d的IF含量高于其它各组。提示：GC可升高不天数的磨素化模型公展脑组织的 SOD活性，降低MDA、LF的含量：GCs对模型小鼠脑组织30天后 SOD活性的升高显示出一定的量效关系，也以GCs中、大剂量的作用较明显。模型小鼠脑海马 CA1区神经细胞数量明显减少，细胞皱缩，胞体变小，胞浆界限不清，可见凋亡小体，与GCs大剂量组、VitmnE及 NC组海马 CA1区组织形态学变化不同。以上实验结果提示：GCs对脑老化模型小鼠的保护作用，以大剂量即GC-125mg／kg可能比较适宜，海马CA1区组织形态学变化也可得到一定的支持证据。其作用机制可能是通过清除自由基或增强自由基清除酶的活性，抑制膜脂质过氧化达到改善 D-gal引起的脑老化的作用。