摘 要：本实验分别运用有机溶剂萃取法和大孔吸附树脂分离法对肉苁蓉苯乙醇苷(PEG)粗提液进一步分离纯化。通过比较分析确定合适的分离纯化方法；并对经分离纯化的苯乙醇苷从还原能力、1,1- 二苯基苦基苯肼(DPPH)自

由基清除能力和亚油酸体系抗脂质过氧化能力三方面进行抗氧化活性评价研究。 结果表明：D101 大孔吸附树脂柱层析较适合苯乙醇苷的纯化工艺，苯乙醇苷抗氧化活性高于阳性对照V E 。

关键词：肉苁蓉；苯乙醇苷( P E G ) ；纯化；抗氧化

肉苁蓉Cistanche salsa(C.A.Mey.)为列当科(Orobanchaceae) ，属多年生高等寄生植物，又名苁蓉、大芸、金笋、地精，是我国名贵中药，药典有收录，主要生长在我国沙漠地带，被誉为“沙漠人参”。肉苁蓉属于寄生植物，全世界约有2 0 种，我国生长的肉苁蓉有盐生肉苁蓉、德赢vwin登录 、沙苁蓉、兰州肉苁蓉、迷肉苁蓉六个种及一变种白花盐苁蓉[ 1 ]。肉苁蓉具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，主治男子阳痿、女子不孕、带下、血崩、腰膝冷痛、血枯便秘等症。肉苁蓉中主要的生物活性成分是苯乙醇甙类化合物(PEG)、多糖、生物碱[2]。苯乙醇甙具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、助阳等作用[ 3 ] 。肉苁蓉苯乙醇苷粗提取物中除苯乙醇苷化合物外，还含有大量的脂质、鞣质、色素以及无机盐类等，因此需对苯乙醇苷粗提物进一步分离纯化。苯乙醇苷的纯化方法较多，如有机溶剂萃取法、大孔树脂吸附层析法、硅胶柱层析法等[ 4 ] 。

大孔吸附树脂分离技术主要是利用特殊的吸附剂——大孔吸附树脂的吸附性和分子筛相结合的原理，从提取液中有选择地吸附住其中的有效成分，去除杂质。特别是非极性吸附树脂在吸附液中的有效成分时，主要是物理结构(如比表面积、孔径等)在起吸附作用。该技术目前已比较广泛地应用于中药新药的开发和中成药的生产中，主要用于分离和提纯苷类、生物碱、黄酮类成分及大规模生产[5]。有机溶剂萃取法是利用提取物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。萃取时如果各组分在两相溶剂中的分配系数相差越大，则分离效率越高，分离的效果就越好[ 6 ] 。萃取常用的有机溶剂有石油醚、氯仿、乙醚、正已烷、乙酸乙酯、正丁醇等。在亲脂性溶剂中如正已烷、乙酸乙酯、正丁醇不仅可实现萃取分离，并且可达到脱脂目的。

苯乙醇苷具有良好的抗氧化活性，在体外可以直接清除羟自由基，并能抑制自发或由羟自由基引发的脂质过氧化反应，可以提高亚急性衰老小鼠S O D 的活性；降低小鼠的脑、肝中的脂质过氧化物的含量，调节衰老机体氧化/ 抗氧化功能的平衡[7-8]。本实验分别运用有机溶剂萃取法和大孔吸附树脂分离法对苯乙醇苷粗提物进一步分离纯化。通过比较分析确定合适的分离纯化方法；并对经分离纯化的苯乙醇苷从还原能力、DPPH 自由基清除能力和亚油酸体系抗脂质过氧化能力三方面进行抗氧化活性评价研究。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂内蒙古盐生肉苁蓉。9 5 % 乙醇、松果菊苷、正己烷、正丁醇、乙酸乙酯、D 1 0 1 大孔树脂、铁氰化钾、D P P H 及亚油酸。

1.1.2 仪器

TU-1810 型751 分光光度计、FW-100 型CF 气流涡旋微粉机、FA2104 型电子天平、HH-S 型恒温水浴箱、LD4-2 型低速离心机及RE52CS 型旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 原料的预处理

将肉苁蓉的肉质茎经切割、干燥后，用粉碎机进行粉碎，粉碎后的肉苁蓉粉末过4 0 目筛，备用。

1.2.2 苯乙醇苷的制备方法

将盐生肉苁蓉进行粉碎、烘干放入容器中，加入87% 乙醇溶液，料液比为1:11，将容器置于水温68℃的水浴锅中，搅拌后回流提取2h，冷却后以5000r/min离心，回收上清液。将残渣以同样的方法再提取一次，合并两次上清液，减压下旋转蒸发浓缩，得浓缩液。

1.2.3 苯乙醇苷的有机溶剂萃取纯化方法将浓缩液分别用乙酸乙酯、正已烷以1:3(V/V)进行萃取，然后再用水饱和正丁醇反复萃取，直至正丁醇颜色变浅，合并正丁醇层，减压回收至干，得正丁醇提取物。

1.2.4 苯乙醇苷类的大孔树脂柱层析纯化方法

1.2.4.1 D101 大孔树脂预处理将D101 大孔吸附树脂分别用95% 乙醇浸泡24h，使树脂充分溶涨，除去树脂中的杂质；乙醇洗涤充分溶涨后的树脂，用纱布过滤，直至滤液中加适量水无白色浑浊物生成为止，改用去离子水洗涤树脂至无乙醇残留；随后对树脂进行酸碱处理，先用5% 的HCl 溶液浸泡树脂3 h ，过滤，然后用去离子水洗至滤液p H 为中性，接着用5 % 的N a O H 溶液浸泡树脂3 h ，过滤，再用去离子水洗至滤液p H 为中性。

1.2.4.2 装柱

采用乙醇湿法装柱，将树脂装入吸附柱中，并保持95% 乙醇面高出树脂面约10mm，浸泡平衡12h。用95% 乙醇洗涤树脂层，直至流出液加两倍蒸馏水不呈白色浑浊，用蒸馏水继续洗至无醇味即可。

1.2.4.3 柱层析

将苯乙醇苷浓缩液沿管壁加入D101 大孔吸附树脂柱层面，先用蒸馏水洗脱，再用7 0 % 乙醇洗脱直至洗脱液为无色，最后再用蒸馏水洗脱控制流速为1.2ml/min，分别收集洗脱液并测定苯乙醇苷含量。

1.2.4.4 再生

用95% 乙醇洗涤用过的树脂，直到洗脱液近无色，用蒸馏水洗涤树脂层至无醇味，必要时用1～2 倍树脂体积的4%NaOH 溶液洗涤树脂层，用蒸馏水洗至中性，备用。

1.2.5 苯乙醇苷的抗氧化活性测定方法

1.2.5.1 总还原力测定(铁氰化钾法)

在2.5ml pH6.6磷酸缓冲溶液中加入1ml样液、2.5ml1% 铁氰化钾，混合物在50℃恒温条件下，加热20min。急速冷却，加2.5ml 10% 三氯乙酸，混匀后以3000r/min离心10min。取上层清液2.5ml，加2.5ml 蒸馏水再加

0.5ml 0.1%FeCl3，混合均匀，静置10min 后，在700nm处测定吸光度[9-10]。

1.2.5.2 苯乙醇苷类D P P H ·清除活性测定取不同浓度的样品2ml，加入0.004% DPPH 乙醇溶液2ml，经混合后在室温下反应30min，测定517nm 处吸光度(Ai)；同时测定DPPH 乙醇溶液2ml+ 乙醇2ml 的吸光度(A0)和溶液2ml+ 乙醇2ml 的吸光度(Aj)。按下式计算D P P H ·清除率[ 1 1 ]。

1.2.5.3 苯乙醇苷抗脂质过氧化活性测定取1ml 一定浓度的样品液或抗氧化剂溶液、4ml 的0.05mol/L (pH7.0)的磷酸盐缓冲液、2ml 去离子水、1ml无水乙醇、0.417ml AAPH，与2ml(2.5%)亚油酸混匀，避光，于40℃水浴反应；同时用1ml 无水乙醇代替样品液或抗氧化剂溶液，按上述方法处理，作为空白对照。分别在反应进行50、100、150、200、250min 时，取0.1ml 该反应溶液，加入4.7ml 75%的乙醇和0.1ml 30%的硫氰酸铵，5min 后，再加入0.1ml 0.02mol/L 溶解于3.5%的盐酸中的FeCl2，混匀，准确反应3min，在500nm处测定吸光度[12]。

2 结果与分析

2.1 苯乙醇苷的有机溶剂萃取

由表1 可以看出，使用正已烷进行萃取，有机相中苯乙醇苷的残留率为0.3%，而用乙酸乙酯进行萃取，有机相中苯乙醇苷的残留率为8 % 。由此可以得知，使用正已烷进行萃取残留率低，同时达到了脱脂效果。因此，本实验采用正已烷- 正丁醇作为萃取溶液。

2.2 苯乙醇苷D101 大孔树脂层析纯化

D101 大孔吸附树脂分离萃取液中苯乙醇苷的洗脱曲线如图1 。由图1 可知，通过乙醇洗脱，可以得到一个苯乙醇苷洗脱峰，说明使用D101 大孔树脂分离苯乙醇效果较好。收集合并乙醇洗脱液，得到苯乙醇苷的乙醇溶液。

由表2 可以看出，使用有机溶剂进行萃取，萃取液中苯乙醇苷类浓度为6.241mg/ml，回收率为82.5%。使用D101 大孔吸附树脂进行分离纯化，分离液中苯乙醇苷类浓度为5.395mg/ml，回收率为71.3%。比较得知两者萃取效果相差不大，但从使用有机溶剂萃取步骤的复杂性、不安全、且残留率较大等方面综合考虑，认为使用大孔吸附树脂分离方法比较适合肉苁蓉苯乙醇苷类的纯化。

由图2 可以看出，在0.01～0.5mg/ml的浓度范围内，苯乙醇苷(PEG)、VC、BHT 随着浓度的增加还原能力呈线性增加。还原力的大小顺序依次为：VC ＞ BHT ＞苯乙醇苷(PEG)。其中当浓度超过0.5mg/ml 时还原能力变化缓慢，苯乙醇苷(PEG)的还原能力略低于BHT，但强于VC，这说明苯乙醇苷(PEG)具有较强的还原能力。

2.4 苯乙醇苷D P P H ·清除活性

由图3 可以看出，在2～60μg/ml 范围内，苯乙醇苷(PEG)清除DPPH·能力随浓度增加呈线线增加趋势。苯乙醇苷( P E G ) 清除率略低于B H T 、V C ，但高于VE ，说明苯乙醇苷(PEG) 是一种较好的DPPH·清除剂。当浓度达到60～70μg/ml 时四者自由基清除率基本接近，由此得出苯乙醇苷(PEG)具有很强的抗氧化性。

由图4 可以看出，苯乙醇苷(PEG)、VE 和BHT 能明显抑制脂质过氧化物的形成，它们的吸光度都显著低于空白，苯乙醇苷(PEG)与BHT 的过氧化抑制能力几乎相同，但都显著地高于VE。苯乙醇苷(PEG)浓度分别为0.1、0.5mg/ml 时，都能显著抑制过氧化物的生成，且浓度为0.5mg/ml苯乙醇苷(PEG)抑制过氧化物生成量显著高于0.1mg/ml 时的苯乙醇苷(PEG)。说明随着苯乙醇苷(PEG)浓度增大其抗氧化性也增强。

3 结 论

3.1 采用正己烷- 正丁醇作为萃取液，PEG 的萃取效果较好。但相对于柱层析，有机溶剂萃取操作复杂、不安全、污染大。D101 大孔吸附树脂柱层析较适合苯乙醇苷(PEG)的纯化。

3.2 在浓度超过0.5mg/ml 时，PEG 还原能力略低于BHT，但显著高于VC；在2 ～6 0μg/ml 范围内，苯乙醇苷(PEG)清除DPPH·能力略低于BHT、VC，但显著高于VE；苯乙醇苷(PEG) 抗脂质过氧化能力与BHT 相当，但显著高于V E 。以上结果说明，苯乙醇苷( P E G )具有较强的抗氧化能力。

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