摘要:目的观察肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠精子膜结构和氧化损伤的干预作用, 探讨肉苁蓉苯乙醇苷治疗弱精子症男性不育的作用机制。方法取大鼠精子制备精子悬液, 并分为正常组, 药物空白组, 模型组, 阳性药对照组(维生素C组)和肉苁蓉苯乙醇苷提物小、中、大剂量组, 应用FeSO4 /H2O2体系产生活性氧(ROS), 在有氧环境下, 不同剂量(0.025, 0.25,0.5 g/ml生药量)的肉苁蓉苯乙醇苷与精子悬液共同孵育后, 检测精子膜脂质过氧化损伤程度, 通过精子低渗膨胀试验评估精子膜功能, 并与已知的抗氧化剂维生素C对照。结果肉苁蓉苯乙醇苷小、中、大剂量组(0.025, 0.25, 0.5 g·ml-1 )在相同的条件下均可提高精子悬液SOD活力, 降低MDA含量, 对精子膜功能具有一定的保护作用。其中0.25,0.5 g· ml- 1的肉苁蓉苯乙醇苷组明显优于维生素C组(P< 0.01或P< 0.001)。结论肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠精子膜的脂质过氧化损伤具有明显的干预作用, 对精子膜结构和功能具有明显的保护作用。

关键词:肉苁蓉;　苯乙醇苷;　精子;　脂质过氧化

肉苁蓉作为一种名贵的中药材, 近年来对它的研究较多。肉苁蓉的活性成分主要包括苯乙醇苷类化合物(Phenylethanoidglycosides,PhGs)、肉苁蓉多糖、甜菜碱、黄酮等物质, 其中PhGs是肉苁蓉中最为重要的活性成分之一。

PhGs是一类含有羟基、甲氧基取代苯乙基和羟基、甲氧基取代肉桂酰基的化合物, 通常以β -葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷, 广泛存在于双子叶植物中。苯乙醇苷类化合物主要由咖啡酸、苯乙醇苷元和糖三部分组成, 包括海胆苷(Echinacoside)、麦角甾苷(Acteoside)、异麦角甾苷(Isoacteoside)、2-乙酰基麦角甾苷( 2′- acetylacteoside)等。许多研究结果表明, 苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆及性机能等作用。由于PhGs分子含有多个酚羟基, 能够结合体内自由基, 避免其在体内的大量蓄积, 保护机体免受过量氧化损伤, 是抗氧化和抗衰老的主要成分[ 1] 。

尽管肉苁蓉以复方形式多次出现在治疗男性少精、弱精疾病的中药配伍中[ 2] , 但就其所发挥作用的机理研究尚不全面。除去其可呈现出的雄性激素和促性腺激素样作用进而提高精子数量和活力的作用外[ 3] , 研究其抗氧化功效在治疗弱精、少精疾病中所做贡献还是新的尝试。本文以肉苁蓉提取物对大鼠精子体外膜功能氧化损伤的保护作用为题, 体外应用FeSO4 /H2O2 体系建立氧化应激损伤[ 4] , 探讨肉苁蓉抗氧化功效在治疗这类疾病中所发挥的作用。

1　材料

干燥德赢vwin登录 肉质茎(购自内蒙古中蒙医院)。电子天平PL2002, 自制色谱柱(1.5 cm×20 cm), 旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂), 大孔吸附树脂, 玻璃容器若干, 高速台式离心机, 水浴锅,二氧化碳细胞培养箱(SANYO), 酶标仪, 血球计数板。SOD试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所), 低渗膨胀液:柠檬酸钠0.735 g, 果糖1.351 g, 双蒸水100 ml。伊红Y溶液:伊红Y0.5 g, 溶于等渗生理盐水100 ml。雄性Wistar大鼠[ 购自内蒙古大学实验动物中心, 实验动物批号:SCXK(蒙)2002 0001] , 体质量(200 ±20)g。

2　方法

2.1　肉苁蓉苯乙醇苷的提取、分离[ 5] 取干燥的肉苁蓉30 g, 粉碎后过20目筛。加入8倍量70%乙醇, 以70℃提取, 提取两次,合并两次提取物。按图1操作后浓缩药液, 用聚乙烯微孔滤管过滤, 浓缩药液至相当于生药量0.5 g· ml-1, 冷藏保存。

2.2　正常精子悬液制备[ 6] 取数只大鼠附睾, 置于温浴37℃PBS, 洗去毛发和血液, 转至有20 mlPBS的培养皿中, 剪开附睾头部, 待精子充分游离后, 将上清液用200目滤网过滤, 反复操作至上清液变清, 计数板计数, 用PBS调整细胞浓度为2 ×107个/ml。

2.3　大鼠精子过氧化损伤模型的建立将精子悬液分为6 组:正常组为PBS缓冲液(pH 7.14);FeSO4 /H2O2组(FeSO4 终浓度0.02 mmol· L-1, H2O2终浓度1 mmol· L-1 );阳性药对照组为维生素C(终浓度为0.25 mg· ml-1 ) + FeSO4 /H2O2 (FeSO4终浓度0.02 mmol· L-1, H2O2 终浓度1 mmol· L-1);肉苁蓉小、中、大剂量组为肉苁蓉提取物(终浓度分别为0.025, 0.25, 0.5 g· ml-1 ) + FeSO4 /H2O2 (终浓度同模型组);各组样本置37 ℃,5%CO2 培养箱中孵育0.5h。

2.4　总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力测定精子悬液孵育2 h,按试剂盒说明书操作, 用分光光度计测定。波长550 nm处比色,结果以每毫升酶单位表示。SOD活力单位为抑制反应50%的SOD量。SOD活力(U· ml-1) =(A对照- A样品) ÷ A对照÷ 50%×样品稀释倍数。

2.5　丙二醛(MDA)含量测定精子悬液孵育2 h, 按试剂盒说明书操作, 用分光光度计测定。波长532 nm处比色。精子膜脂质过氧化损伤的程度以MDA的产量来表示(nmol/107 个精子)。MDA量(nmol/107 个精子) = (A样品- A空白) ÷(A标准- A空白)×对照品浓度(10 nmol· ml-1 )×样品稀释倍数。

2.6　精子存活率测定精子悬液经温育30 min和90 min后分别取5 μl与等量的曙红-Y混匀, 室温下放置2 min, 加盖玻片,在明视野400 ×显微镜下15 min内观察, 死精子被染色呈粉红色, 活精子不被染色而胞质透明。每份标本计数200个精子计算存活率。

2.7　精子低渗膨胀实验(HOS) 取低渗肿胀试剂1 ml, 37℃预温5 min, 分别加入处理过的精液100 μl混匀, 37℃水浴孵育30min, 取5 μl精子悬液于精子计数盘中, 计算200个精子中b-g型肿胀精子的百分率。

3　结果

3.1　肉苁蓉苯乙醇苷定性鉴定采用薄层层析法对肉苁蓉中PhGs定性分析, 正丁醇-乙酸-水(5∶ 4∶ 1)为展开剂, 展开晾干后, 喷以氯化铁-乙醇显色剂。PhGs含有酚羟基, 会与Fe3 +发生反应显紫色。测得Rf值0.24和0.78 较明显, 与文献松果菊柑和麦角甾苷0.23和0.73基本吻合。

3.2　肉苁蓉PhGs对于大鼠精子氧化损伤后对精子存活率的影响精子悬液孵育30 min后各组的精子存活率由于实验条件的原因, 存活率均有降低。维生素C组和肉苁蓉提取物小、中、大剂量组的精子存活率显著高于模型组(P<0.001);30 min和90 min的精子活率, 0.025 g· ml-1肉苁蓉提取物组与维生素C组无明显差异, 0.25和0.5 g· ml-1肉苁蓉提取物组的精子存活率显著高于维生素C组(P<0.01或P<0.001);90 min后精子存活率进一步降低, 0.5 g· ml-1肉苁蓉提取物组的精子存活率保持在较高水平, 与正常组相比无显著差异(见表1)。

3.3　对精子尾部低渗膨胀试验的影响低渗膨胀试验通过低渗溶液来检测精子尾部细胞膜的状况, 从而了解其运动机能的实验方法。g型精子尾部全部膨胀, 表示细胞膜无损, 机能良好。在精子低渗膨胀率试验中, 模型组显著低于正常组(P<0.001)。其中, 精子的总膨胀率(b-g型)[ 7, 8] :肉苁蓉提取物小剂量组与维生素C组相比无显著性差异, 中、大剂量组显著高于维生素C组(P<0.001), 甚至接近正常组;对于g型精子膨胀率影响, 0.025 g· ml-1肉苁蓉提取物组与维生素C组(0.25 mg·ml-1)相比无显著性差异, 但中、大剂量肉苁蓉提取物组显著优于维生素C组(P< 0.01)。见表2。

3.4　肉苁蓉PhGs对于大鼠精子氧化损伤后T-SOD活力、MDA含量的影响精子悬液孵育0.5 h后, 模型组的T-SOD活力显著低于正常组(P<0.001), MDA量显著高于正常组(P<0.001);维生素C组和肉苁蓉提取物小、中、大剂量组的T-SOD活力明显高于正常组和模型组(P均<0.001), MDA量显著低于模型组(P<0.001)。对SOD活力和MDA量的影响, 0.025 g· ml-1的肉苁蓉提取物组与维生素C组(0.25 mg· ml-1 )之间无明显差异;0.25, 0.5 g· ml-1的肉苁蓉提取物组显著优于维生素C组(P< 0.05)。见表3。与维生素C组比较P< 0.001。而药物空白组中与正常组无显著性差异。

4　讨论

ROS包括氧离子, 自由基和超氧负离子, 是由精子和精子粒细胞产生并主要通过两种机制导致不育。第一, 它破坏精子细胞膜, 降低精子活力以及和卵子结合的能力;第二, ROS可以改变精子DNA, 导致缺陷的父系DNA作用于孕体。我们已知精子膜富含多聚不饱和脂肪酸, 在有氧条件下极不稳定, 易发生精子膜脂质过氧化(lipidperoxidation, LPO), 使膜的液态性、流动性及通透性发生改变, 造成精子膜的损伤, 甚至细胞死亡。MDA作为LPO反应的最终产物之一, 其含量可从一定程度上反映精子膜LPO损伤情况[ 9] 。SOD是精子所拥有的防御ROS的主要酶系。低渗膨胀试验:为WHO推荐的一种可供选择的检查精子存活力的补充试验方法。部分学者认为, 精子低渗膨胀实验可作为精子膜功能指标之一。本文应用FeSO4 /H2O2 体系产生ROS, 造成氧化应激损伤模型, 研究了肉苁蓉提取物对大鼠精子膜结构和功能氧化损伤的保护作用。结果表明, 在ROS的作用下大鼠精子膜结构和功能明显受到损伤, 精子悬液T-SOD活力显著降低, MDA含量显著增高, 精子膨胀率(总膨胀率、g型精子膨胀率)明显降低, 精子存活率显著下降, 与正常组相比差异极显著(P<0.001)。肉苁蓉提取物小、中、大剂量组(0.025, 0.25, 0.5 g· ml- 1)在相同的条件下均可提高精子悬液SOD活力, 降低MDA含量, 对ROS所致精子膜的氧化损伤均具有不同程度的干预作用, 对精子膜功能具有一定的保护作用。肉苁蓉提取物的作用呈剂量依赖性, 大剂量(0.5 g· ml- 1 )时对精子膜功能的保护作用最显著。肉苁蓉具有抗氧自由基活性, 对羟自由基及超氧阴离子自由基均有良好的清除作用。本实验结果显示, 适量肉苁蓉提取物能显著提高精子悬液SOD活力, 降低MDA含量, 抑制精子膜脂质过氧化反应, 发挥抗氧化作用, 对精子膜结构和功能具有明显的保护作用。这可能是在已有的可呈现出雄性激素和促性腺激素样作用外, 肉苁蓉在治疗弱精子症男性不育中所表现出的另一项新药理机制。

参考文献:

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