【摘要】目的： 观察肉苁蓉苯乙醇苷类成分(CPhGs)对牛血清白蛋白(BSA)诱导的免疫性肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响，探讨其治疗肝纤维化的效果及机制。方法：将75只SD大鼠随机分为6组，即正常对照组，肝纤维化模型组，阳性对照组(复方鳖甲软肝片600 mg/kg)，以及CPhGs高(500 mg/kg)、中(250 mg/kg)、低(125 mg/kg)剂量组。CPhGs高、中、低剂量组每组各13只，其余每组各12只。采用皮下及尾静脉注射BSA诱导建立大鼠肝纤维化模型，造模同时灌服相应剂量的受试药物，正常对照组和模型组灌胃给予蒸馏水，其余各组均按设定剂量灌胃给药；给药结束后收集大鼠血清、肝组织，采用全自动生化仪检测大鼠肝功能酶指标，包括血清白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TB)、血清直接胆红素(DB)水平；放射免疫法检测血清肝纤维化标志包括血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)含量；ELISA测定血清TGF-β1水平；Masson染色观察肝脏病理组织学变化；免疫组化法测定肝组织中TGF-β1的表达。结果：与模型组相比，CPhGs各剂量组肝纤维化大鼠血清中ALB含量增加，中、高剂量组TB、DB 含量降低，各剂量组大鼠肝纤维化指标含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)，血清TGF-β1含量降低(P<0.01)，Masson染色结果显示CPhGs各剂量组肝纤维化程度减轻，均显著低于模型组(P<0.01)，各剂量组肝组织中TGF-β1蛋白的表达也明显受到抑制(P<0.05或P<0.01)。结论：CPhGs对BSA诱导的免疫性肝纤维化大鼠具有较好的保护作用，对TGF-β1表达的抑制作用可能是其作用机制之一。

【关键词】肉苁蓉；苯乙醇苷类；肝纤维化；牛血清白蛋白；转化生长因子β1、

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝脏遭受反复或慢性损伤后的一种损伤与修复过程，主要与慢性炎症[1-3] 和引起慢性肝脏损伤的化学因素相关，已成为一个发病率和死亡率都很高的世界医学难题，各种肝病多数经肝纤维化最后发展为晚期肝硬化，成为肝病死亡[4] 的主要原因。目前研究已经明确：肝纤维化是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成与降解失衡的动[5] 态过程；肝纤维化及早期肝硬化是完全可逆转的。中医药治疗肝纤维化有悠久的历史和肯定的临床疗效，研究证实，中医药治疗肝纤维化具有多靶点、多环节、多途径复合作用的特点。肉苁蓉(cistanche)是著名的名贵补益类中药。因其疗效确切，药性温和，所以自古就被视为强壮、滋补的中药，有“沙漠人参”之美誉，化学及药理作用研究显示肉苁蓉苯乙醇苷类(cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)成分是[6] 其发挥药效的主要物质基础之一。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调[7-11] [12] 节等多种生物活性。Peter等于1989年首次发现苯乙醇苷类化合物松果菊苷具有显著的保肝护肝作用，随后引起人们对CPhGs进行抗肝炎研究的兴趣，本文通过建立牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)诱导的免疫肝纤维化大鼠模型，观察CPhGs对大鼠血清肝功能、肝纤维化指标、病理学变化及血清与肝组织中TGF-β1表达的影响，以期阐明CPhGs抗肝纤维化的可能作用机制，为进一步的新药开发提供基础数据。

1 材●料

1.1 主要试剂与仪器

德赢vwin登录 新鲜肉质茎6.0 kg，经70%乙醇热回流提取3次，每次3 h，合并提取液。AB-8树脂纯化得到提取物即苯乙醇苷的乙醇提取物，后经新疆维吾尔自治区药物研究所赵军研究员鉴定为CPhGs，纯度为70%。用0.5%的羧甲基纤维素钠 (sodium carboxyl methylcellulose-Na，CMC-Na)将其配制成不同浓度，置4 ℃冰箱保存待用。复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞科技股份有限公司产品)，BSA(Sigma公司产品)。羊毛脂(上海源叶生物科技公司)，液体石蜡(天津市富宇精细化工有限公司)，磷酸盐缓冲液(飞世尔生物化学制品北京有限公司)。大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)夹心ELISA试剂盒(联科生物技术有限公司)，兔抗TGF-β1抗体0.2 m L(BIOSS公司)。电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，L-530多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，全自动生化分析仪(迈瑞公司)，化学发光分析仪(泰格科信)。

1.2 方法

1.2.1 动物●雄性健康SD大鼠75只，SPF级，体质量180～220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(新)2011-0004。SPF级实验动物使用许可证号为SYXK(新)2011-0004。

1.2.2 分组及给药●将SD大鼠随机分为6组，即正常对照组，肝纤维化模型组，阳性对照组(复方鳖甲软肝片600 mg/kg)， 以及CPhGs高(500 mg/kg)、中(250mg/kg)、低(125 mg/kg)剂量组。CPhGs高、中、低剂量组每组各13只，其余每组各12只。除正常组外，大鼠[13] 采用朱启贵等的方法制备免疫性肝纤维化模型：造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段，除正常对照组注射生理盐水 (每只0.5 mL)以外，其余各组动物均多点皮下注射含弗氏不完全佐剂的9 mg/mL BSA，每次0.5 mL，共5次。前两次注射间隔为14 d，后3次注射间隔为7 d。末次致敏注射后1周，每只动物于眼球后静脉丛采血，采用双向扩散法检测大鼠血清抗BSA抗体。抗体阳性大鼠继续进行尾静脉攻击，即模型组和给药组大鼠尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2 m g逐渐递增至4 m g；正 常对照组尾静脉注射生理盐水。造模同时给药，除空白对照组和模型组灌胃给予蒸馏水外，其余各组均按设定剂量灌胃给药；造模结束后继续给药4周，实验周期共计15周。

1.2.3 血清各项指标含量的检测●各组大鼠于末次给受试物后禁食(不禁水)24 h，称体质量，经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉、腹主动脉取血，3 000 r/min离心10min分离血清，全自动生化仪检测3项肝功能酶指标，包括血清白蛋白(serum albumin，ALB)、血清总胆红素(total bilirubin，TB)、血清直接胆红素(direct bilirubin，DB)含量；双抗体夹心酶联免疫法，测定血清TGF-β1水平；化学发光免疫分析仪检测肝纤维化4项即血清透明质酸(clolinesterase， HA)、层黏连蛋白(1aminin，LN)、Ⅲ型前胶原(prcocollagen type Ⅲ，PC Ⅲ)、Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen，Ⅳ-C)水平。

1.2.4 肝脏组织病理学观察●所有大鼠均取同一部位肝组织，用40％的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片并进行Masson染色，显微镜下观察组织学变化。肝纤维化分级参照文献[14]分为5级：0级，无纤维化；I级，纤维结缔组织仅限于汇管区或汇管区有扩大，有向小叶发展的倾向；II级，纤维结缔组织增生明显，超过小叶的2/3并伴有I级改变；Ⅲ级，纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围；IV级，纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有Ⅲ级改变。

1.2.5 肝脏组织TGF-β1表达的检测●组织切片用Nikon Digital Sightds-Fi2型生物显微镜进行观察，并用K12320型显微摄像系统在低倍镜(×100倍)下选取清晰视野拍照。采用Motic Med 6.0 CMIAS彩色图像分析软件，通过显微摄像系统放大200倍，每张切片随机选取3个视野，每个视野随机选取5个2 cm×3 cm大小的区域，TGF-β1免疫组化阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒状染色，测定其平均光密度值(MOD)，值越大表明组织中该抗原含量越高。计算公式如下：MOD=胶原面积/肝组织面积×100%

1.3 统计学方法

用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据采用 x-±s表示；多组间均数比较采用方差分析One-way A NOVA，多组样本均数两两比较采用LSD方法分析，有序分类资料采用Ridit分析，检验水准α=0.05。

2 结●果

2.1 CPhGs对BSA致肝纤维化大鼠肝功能酶指标的影响

与正常对照组比较，肝纤维化模型组ALB含量明显降低，TB、DB含量明显增加，差异均具有统计学意义(P均<0.01)。与肝纤维化模型组比较，阳性对照组和CPhGs高、中、低剂量组大鼠血清ALB含量显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；阳性对照组和CPhGs高、中剂量组大鼠血清TB、DB含量均显著降低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)；同时，CPhGs各剂量组对于TB、DB活性存在一定的剂量依赖关系(r=0.666，r=0.749，P均<0.05)，提示CPhGs能够降低肝纤维化大鼠肝细胞的损害程度，改善肝纤维化大鼠肝功能，对肝细胞损伤具有保护作用，见表1。

2.2 CPhGs对BSA致肝纤维化大鼠血清肝纤维化标志HA、LN、PCIII、IV-C含量的影响与正常对照组比较，模型组大鼠血清肝纤维化标志HA、LN、PCIII、IV-C含量均显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，CPhGs不同剂量组及阳性对照组血清中HA、LN、PCIII、IV-C含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，其中，CPhGs各剂量组LN、IV-C活性降低具有一定的剂量依赖关系(r=0.595，r=0.593，P均<0.05)，提示CPhGs能够降低大鼠纤维化程度，见表2。

2.3 CPhGs对BSA致肝纤维化大鼠血清TGF-β1含量的影响与正常对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清TGF-β1含量明显增加， 差异具有统计学意义(P<0.01)。与肝纤维化模型组比较，阳性对照组及CPhGs高、中、低剂量组血清中TGF-β1含量均显著降低(P均<0.01)，且CPhGs各剂量组TGF-β1含量降低具有一定的剂量反应关系(r=0.490，P<0.01)。提示CPhGs可能通过降低肝纤维化大鼠血清中细胞因子TGF-β1的含量治疗肝纤维化，见表3。

2.4 大鼠肝组织病理学观察

Masson染色显示，正常对照组大鼠肝组织未见炎细胞浸润，肝小叶结构完整清晰，肝细胞呈索状分布，未见不规则血窦，汇管区无扩大(见图1A)。肝纤维化模型组大鼠呈Ⅲ～Ⅳ级纤维化，胶原纤维延伸连接，包绕整个肝小叶使正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大方型假小叶为主(见图1B)。阳性对照复方鳖甲软肝片组与CPhGs高、中、低剂量组治疗效果显著，病理组织切片示形态基本上与正常对照组接近(见图1C~1F)。根据肝纤维化评分标准，模型组肝纤维化程度与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；阳性对照复方鳖甲软肝片组与CPhGs不同剂量组肝纤维化程度减轻，均显著低于模型组(P<0.01)。见图1及表4。

2.5 肝脏组织中TGF-β1表达的差异

光镜下观察：TGF-β1在正常组大鼠肝脏细胞中几乎不表达，少量表达也仅限于间质细胞内(见图2A)；模型对照组TGF-β1表达广泛分布于汇管区、纤维间隔、肝窦壁及细胞胞浆内、肝星状细胞、炎症细胞及其周围。尤其汇管区内呈强阳性表达，染色呈棕黄色(见图2B)；阳性对照复方鳖甲软肝片组与CPhGs各剂量组TGF-β1的表达仅在汇管区和纤维间隔内可见少量阳性细胞，染色呈浅棕黄色(见图2C~2F)；各组大鼠肝组织中TGF-β1 表达的差异及平均光密度值见图2及表3。

3 讨●论

慢性肝炎向肝硬化发展的必经途径是肝纤维化，因此，积极探索肝纤维化的治疗在临床研究中具有十分重要的意义。国内外文献证实，慢性肝炎在早期肝纤维化阶段经过治疗大多数可以逆转或治愈，改变了[15] 传统的肝纤维化不可治愈的观念。抗肝纤维化多年来一直是医学界重点研究的医学难题，新世纪以来，[16] 中医药在抗肝纤维化治疗研究领域取得长足进步，发现气阴不足、瘀血阻络是肝纤维化的中医基本病机[17] 根源。脏器系数是毒理试验中常用的指标，此法简单易行，而且比较敏感。动物染毒以后，受损脏器质量可能发生变化，故脏器系数也会随之改变。脏器系数增大，则表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，则表明脏器萎缩以及其他退行性改变。本课题组前期研究显示CPhGs不同剂量组大鼠肝脾指数明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示CPhGs能够[18] 降低肝纤维化大鼠的肝、脾质量。血清白蛋白(ALB)、胆红素等生化指标是反映肝细胞损害的敏感指

标，对估计肝硬化患者肝脏的储备功能，了解病情变[19] 化及预后判定具有重要的临床价值。肝脏是合成ALB的唯一器官，血清ALB水平下降提示蛋白合成能力减弱，常见于肝硬变合并腹水及其他肝功能严重损[20] 伤(如急性肝坏死、中毒性肝炎等) 。血清胆红素通常在正常水平，只有在肝脏严重受损或肝硬化时，胆红素水平才会升高。本实验结果表明，模型组血清中的TB和DB水平与正常对照组比显著升高，ALB水平显著降低，说明免疫性肝损伤模型构建成功；而CPhGs不同剂量组均能使血清ALB含量明显升高P< 0.05)，高、中剂量组TB及DB含量明显下降(P<0.05)， 表明CPhGs具有保护肝细胞作用。血清HA、LN、PCIII、IV-C是反映肝纤维化活动程度的重要指标。当肝细胞受损时，各种细胞因子及

ECM本身的破坏可激活LN的合成，故LN和IV-C的升高程度与肝纤维化程度成正相关。HA是一种由间质细胞合成的大分子糖胺多糖，主要由肝星状细胞(hepaticstellate cell，HSC)产生，经淋巴细胞进入血液循环，分布在各种结缔组织中，除少量滞留于脾脏、淋巴结和骨髓外，大多数由肝窦内皮细胞摄取并降解为乙酸和乳酸。血清HA水平是反映肝损伤严重程度、判断有无活动性肝纤维化和肝硬化的定量指标。PCⅢ作为Ⅲ型胶原的前体主要在活化的HSC合成与释放，其含量可直接反映Ⅲ型胶原代谢及肝纤维化早期病变，其水平的高低可作为慢性肝组织炎症坏死、纤维化程度和[21] 肝纤维化、肝硬化诊断的重要指标。本研究结果显示， CPhGs能显著降低HA、LNPCIII、IV-C的含量，说明其具有明显的抗免疫性肝纤维化作用，与文[22] 献报道结果一致。血清TGF-β1水平对判断早期纤维化具有临床意义，TGF-β1能够作为肝纤维化独立因子用于临床早期[23] 肝纤维化的诊断。血清TGF-β1水平增高的机制可能是由于疾病在发生发展的过程中，肝脏肿瘤细胞过度表达TGF-β1。本实验结果表明，与正常对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清TGF-β1含量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与肝纤维化模型组比较，阳性对照复方鳖甲软肝片组及CPhGs高、中、低剂量组血清中TGF-β1含量均显著降低(P<0.01)，进一步提示CPhGs可以通过TGF-β1途径减轻大鼠肝纤维化的发生和发展。TGF-β1是一个多功能的生长因子，目前被公认为是致纤维化最强有力的细胞因子之一，参与细胞的生[23] 长、分化及凋亡，刺激 ECM的合成和沉积，尤其TGF-β1在肝纤维化的发展中具有重要作用，可作为检[24] 测肝纤维化的重要标志物，其表达水平与肝纤维化

[25] 的严重程度呈显著正相关。所以，通过检测TGF-β1的表达水平，可以明确肝纤维化病变产生的规律，并可进一步探究其逆转的机制。本研究以免疫组化图像分析检测TGF-β1的表达量后发现，CPhGs高剂量组的TGF-β1(免疫组化染色后阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒)表达明显减弱，表达的面积缩小，颜色从棕黄色变为浅黄色；实验研究还发现，CPhGs高剂量组的TGF-β1表达量明显低于复方鳖甲软肝片组和模型组。我们分析结果后推测，可能由于CPhGs具有明显的降低TGF-β1表达量的作用，下调TGF-β1的表达，而抑制HSC活化、增殖，从而减少胶原合成，使ECM的合成减少，而达到抗肝纤维化的作用。

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