【摘要】目的： 探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)对转化生长因子β1(TGF-β1)介导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化作用及对TGF-β1/Smad信号通路表达的影响。方法：试验分为正常对照组、5 ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度(25、50、75和100 μg/mL)CPhGs给药组，另设只加DMEM培养液的空白组。体外培养HSC-T6细胞，通过四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞的增殖；LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性；采用荧光定量PCR(qPCR)检测Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；采用Western blot法检测Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果：与正常对照组比较，TGF-β1模型组显著促进了HSC-T6细胞的增殖，而50~100 μg/mL的CPhGs可以抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖(P<0.05)，且25~100 μg/mL的CPhGs 对HSC-T6无明显细胞毒性作用；25~100 μg/mL CPhGs均可抑制Smad2和Smad3 mRNA和蛋白水平的表达，且明显抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化水平，促进Smad7 mRNA和蛋白的表达，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断TGF-β1/Smad通路进而阻断HSC-T6细胞的活化和增殖有关。

【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；转化生长因子β1；肝星状细胞；肝纤维化

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)的发生与慢性肝脏炎症及损伤等化学因素相关，它是肝脏在慢性或反复[1-3] 损伤后的一种损伤与修复过程，是目前发病率和死亡率都很高的世界医学难题。肝星状细胞(hepatic

stellate cells，HSC-T6)的活化是肝纤维化发生发展的[4-6] 关键环节。转化生长因子β1(transforming growthfactor-β1，TGF-β1)被公认是致肝纤维化最强有力的细胞因子之一，它参与细胞的生长、分化及凋亡，激活

HSC-T6，刺激细胞外基质(extracellular matrix，[7] ECM)的合成和沉积，TGF-β1/Smad信号通路是肝纤维化研究的热点。肉苁蓉(cistanche)是著名的名贵补益类中药，其发挥药效的主要物质基础之一是苯乙醇总苷(phenylethanoid glycosides from cistanchetubulosa，[8] CPhGs) ，研究显示CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种化学作[9-13] 用及药理作用。前期研究显示，CPhGs能够防治牛

血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)所致的大鼠免[14] 疫性肝纤维化，并能显著降低肝纤维化大鼠血清TGF-β1的水平，抑制肝纤维化大鼠肝组织中TGF-[15] β1的表达，改善大鼠肝纤维化程度。而CPhGs治疗肝纤维化的作用是否与TGF-β1所介导的TGF-β1/Smads信号转导通路有关？为深入探讨CPhGs 治疗肝纤维化的作用机制，本研究以HSC-T6为靶细胞，采用体外给药从TGF-β1/Smad信号转导通路的角度来探讨CPhGs抗肝纤维化作用的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

德赢vwin登录 ，取自新疆吐鲁番地区，物种标本凭证存放于新疆中药研究所。CPhGs 由新疆维吾尔自治区药物研究所从德赢vwin登录 中提取纯化，纯度为70%；试验时用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养液溶解，经0.22 μm滤器过滤后，配制成不同浓度。大鼠HSC-T6细胞系购自武汉Procell生物科技有限公司；TGF-β1购自Peprotech公司； 乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)试剂盒购自南京建成生物有限公司；Smad2、Smad3、Smad7、β-actin引物由上海生工生物技术有限公司设计、合成；cDNA反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司；荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自QIAGEN GmbH公司；Smad2多克隆抗体和β-actin单克隆抗体购自武汉Protein Tech公司； Phospho-Smad2 (ser465/467)抗体、Smad3(C67H9)抗体和Phospho-Smad3 (ser423/425)抗体购自Cell Signaling Technology公司；Smad7抗体购自武汉Boster公司；碱性磷酸酶标记的二抗购自美国Invitrogen公司；RIPA裂解液购自美国Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自于美国Millipore公司。

主要仪器有：倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；CO 细胞培养箱(美国Thermo公司)；低温离心机(美国2Sigma公司)；凝胶成像仪、Western blot电泳装置、转移装置(美国Bio-Rad公司)；图像分析仪Alpha Imager2000、图像分析系统(Alpha I nnoteeh公司)。

1.2 HSC-T6细胞的培养和传代HSC-T6细胞常规复苏后，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培养液，在37℃、CO 体积分数为25%及饱和湿度下培养；当细胞呈单层致密状时，常规胰蛋白酶消化传代，24 h换液，72 h再传代；选用对数生长期细胞进行试验。

1.3 MTT法检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞增殖的影响取对数生长期的HSC-T6细胞，消化、离心，以4 5×10 /mL接种于96孔板，每孔200 μL，24 h后细胞完全贴壁展开，吸去培养液，再用含10%小牛血清的

DMEM培养液同步化细胞。试验分为正常对照组、5ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度(25、50、75和100 μg/mL)CPhGs给药组，另设不加细胞只加DMEM培养液的空白组，每孔总体

积200 μL，每组设4个复孔，于37℃、CO 体积分数为25%的培养箱分别培养48 h，MTT法于酶标仪测定吸光度D(490)值。抑制率={[D(490) -D(490) ]-[D(490) -D(490) ]}/ 模型组空白组用药组空白组[D(490) -D(490) ]×100% 模型组空白组

1.4 LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性细胞分组处理同1.3，收集上清液。按乳酸脱氢酶LDH试剂盒说明书步骤进行测定。LDH(U/L)=[D(490) -D(490) ]/[D(490) -D(490) ]× 测定孔对照孔标准孔空白孔0.2 mmol/L×1 0 00

1.5 qPCR检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达的影响细胞分组处理同1.3。CPhGs作用48 h后，收集细胞，总RNA用Trizol提取 (按试剂盒说明书操作)，加0.2mL氯仿抽提纯化，电泳检测完整性，分光光度法测定其含量及纯度，测定D(260)/D(280)值。cDNA合成参照逆转录试剂盒说明书合成，加入待测定指标的引物，引物利用软件Batch Primer 3设计，由上海生工生物公司合成。序列见表1。反应条件：94 ℃变性3 min，94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环30次，终末72 ℃延伸10 min。并以β-actin基因作为内参，以待测基因/β-actin的比值作为待测基因mRNA的相对表达量(2-ΔΔCT)。结果的计算和分析采用IQ5 RealTime PCR检测系统。

1.6 CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中 S mad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7蛋白表达的影响细胞分组处理同1.3。收集各组细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。取等量的蛋白样品30 μg，SDS-PAGE凝胶电泳后100 V恒压转膜70~100 min，5% BSA封闭，分别加入基础抗体(Smad2兔多克隆抗体、p-Smad2兔单克隆抗体、Smad3抗体、p-Smad3兔单克隆抗体，均为1∶1 000稀释，Smad7抗体1∶200稀释，β-actin抗体1∶5 000稀释)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，显色剂显影，GEL DOC XR凝胶成像仪扫描，GEL DOC软件分析结果。以β-actin表达水平作为内参照。试验重复3次。

1.7 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件分析。数据采用 x-±s 表示，多组间比较用单因素方差分析，多组样本的两两比较采用LSD法，剂量相关性采用Pearson相关系数分析；α=0.05为检验水准。

2 结●果

2.1 CPhGs对TGF-β1刺激HSC-T6细胞增殖的影响如表2所示，与正常对照组比较，TGF-β1模型组显著促进了HSC-T6细胞的增殖(P<0.01)，与TGF-β1模型组比较，TGF-β1+CPhGs 组50~100 μg/mL剂量时均不同程度地抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖(P<0.05)，其中TGF-β1+CPhGs 100 μg/mL抑制率最高，达41.60%，抑制作用呈一定的剂量效应(r=0.444，P<0.05)。同样，与正常对照组比较，CPhGs 25~100μg/mL组及TGF-β1组的上清液LDH 有逐渐增大的趋势，但各组间差异均无统计学意义(P>0.05)，这表明CPhGs作用的HSC-T6，大多数细胞膜完整，CPhGs抑制HSC-T6细胞的增殖作用不是由于药物的细胞毒性及TGF-β1的刺激所引起。

2.2 CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的影响如图1所示，实时荧光定量PCR分析表明，与正常

组比较，在TGF-β1模型组Smad2和Smad3的mRNA表达水平显著增高(P<0.01)，Smad7表达水平显著降低(P<0.01)。与TGF-β1模型组比较，在TGF-β1+CPhGs各剂量组，Smad2和Smad3 mRNA水平均明显降低(P<0.05或

P< 0.01)，接近正常组；同时，Smad7 mRNA表达水平在TGF-β1+CPhGs 50~100 μg/mL组较模型组显著增加(P<0.05)。

2.3 Western blot检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSCT6细胞中Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 和Smad7蛋白表达的影响结果如图2所示，与正常对照组相比，TGF-β1模型组Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3的表达显著上升(P<0.01)，Smad7的表达显著下降(P<0.01)。与TGF-β1模型 组相比，TGF-β1+CPhGs各给药组对刺激升高的Smad2、 Smad3、p-Smad2和p-Smad3表达均有不同程度的抑制作用(P<0.05)，并随药物浓度的增大，抑制作用增强；而Smad7表达则相对上升，并随药物浓度的增大表达量增加(P<0.01)。

3 讨●论

肝纤维化是慢性肝损伤后修复反应的动态过程，

HSC-T6的活化和增殖是肝纤维化发生的基础，现已证实肝纤维化发生的关键环节是HSC-T6的激活及其激活后过多的细胞外基质在肝脏沉积所致。HSC-T6的活化是静止的HSC-T6向肌成纤维细胞(myofibroblast， MFB)转化的过程，HSC-T6在肝损伤因子的作用下，由静止的富含VitA的正常形态向 MFB转化，表现为细胞增殖、趋化性、纤维产生、收缩性、VitA的丢失等，以细胞增殖及胶原合成明显增强为主要特征。而TGF-β1是目前公认最重要的致肝纤维化因素之一，以自分泌[16] 和旁分泌两种形式促进 HSC-T6活化。因此，本研究中，探索使用TGF-β1刺激HSC-T6，建立TGF-β1诱导HSC-T6活化的细胞模型。结果显示，TGF-β1+CPhGs50~100 μg/mL剂量组均不同程度地抑制TGF-β1诱导的HSC-T6的增殖，提示抑制HSC-T6增殖可能是CPhGs抗肝纤维化的作用机制之一。

目前最常用的细胞毒性试验是基于细胞膜通透性的改变、细胞内成分释放入上清液的原理，通过检测上清液中某些成分的含量，辨别细胞膜通透性的变化。LDH是活细胞胞浆内酶，正常情况下不能透过细胞膜，当细胞受损时，细胞膜通透性增高，LDH释放[17] 至细胞外。本文中，通过测定上清液中LDH的水平可以反映细胞损伤程度。我们发现不同浓度的CPhGs作用HSC-T6细胞48 h后上清液中LDH水平与空白对照组比较差异不明显，提示，CPhGs在有效抑制HSC-T6增殖的同时，对HSC-T6基本上无毒性。TGF-β1介导的TGF-β1/Smad信号转导在HSC-T6细胞外基质表达调节中的作用是研究肝纤维化的热点课题。Smads是TGF-β胞内最重要的信号通路，不同类型的Smads分子作用各异，Smad2和Smad3可传递促肝纤维化信号， 而Smad7可传递抗肝纤维化信号。Smad2和Smad3过度表达及Smad7被抑制是TGF-β1/Smad通路持续激活，导致细胞外基质大量堆积的原因。因此，通过靶向性阻断Smad2和Smad3信号蛋白，加强Smad7信号蛋白表达有望成为肝纤维化治疗的新途径。结果显示，HSC-T6在TGF-β1刺激下大量活化增殖，Smad2、Smad3 mRNA表达增加，Smad7 mRNA 表达下降，这与CPhGs抑制BSA诱导的肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1的表达和胶原产生(免疫组化)结果一[18] 致。作为抑制型Smad，Smad7在结构上和Smad2 与Smad3有很大不同，因蛋白的序列只有DNA连接的MHl和MH2区，而缺失了C端的SSXS基序，SSXS基序是磷酸化的靶区，故监测不到磷酸化水平，但其作用和功能在各种疾病中也备受关注，Smad7蛋白与活化的I型受体相结合后，可以阻止Smads与Smad4 蛋白形成杂聚体并进行细胞核内转移，通过提高Smad7蛋白的表达来抑制TGF-β1/Smad信号在转导通路中的传递，可为[19] 防治相关的疾病提供一种全新的思路和治疗方法。实验结果显示，CPhGs作用于TGF-β1刺激的 HSC-T6细胞株后，Smad2、Smad3蛋白及其磷酸化水平的表达均降低，Smad7蛋白表达升高，提示CPhGs对TGF-β1/Smad信号通路的影响除了可以作用于转录水平，同时从蛋白水平同样可以抑制Smad2、Smad3蛋白的表达、磷酸化与核转位；升高抑制型Smad7蛋白的表达，也能干扰TGF-β1在细胞内的信号转导，从而减少细胞外基质的生成。提示， CPhGs可能通过阻断TGF-β1/Smad信号通路中Smad2、Smad3的表达及增加Smad7 的表达，或者通过与Smad2、Smad3、Smad7相互作用抑制TGF-β1的效应而起到治疗肝纤维化的作用。综上所述，CPhGs对肝纤维化的防治作用可能与下调Smad2和Smad3表达，上调Smad7表达，阻断肝纤维化关键性效应细胞HSC-T6中TGF-β1/Smad信号转导通路而实现。

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