摘要: 目的研究肉苁蓉苯乙醇总苷对酪氨酸酶活性的抑制作用。方法用L － 酪氨酸作为底物，测定药物干预前后酪氨酸酶的活性，计算酪氨酸酶的抑制率，并以Lineweaver － Burk 双倒数法绘制酶动力学曲线，推断抑制类型。结果苯乙醇总苷对酪氨酸酶的活性具有明显下调作用，对酪氨酸酶的效应表现为竞争型可逆性抑制。结论本研究可为开发利用肉苁蓉中的美白成分提供依据。

关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇总苷; 酶氨酸酶; 抑制作用

黑素( melanin) 是决定人体肤色最重要的因素，它的合成是表皮基底层中黑素细胞的一种应激反应，反应过强，可引起雀斑、黄褐斑、老年斑等色素增加性皮肤病的形成。酪氨酸酶( tyrosinase) 是皮肤黑素生物合成过程的主要限速酶，能将机体内制造黑素的主要原料酪氨酸( tyrosine) 羟化，产生L － 多巴( L － Dopa) ，然后再将多巴氧化成多巴醌( dopaquinone)，多巴醌经过系列的代谢过程，重新排列并聚合，最后与蛋白质结合生成一系列引起褐化的黑素蛋白［1］。近年来，美白化妆品的研制和色素增加性皮肤病防治的研究热点趋向于天然产物，特别是天然药物活性成分对酪氨酸酶的抑制作用［2 － 3］。肉苁蓉是传统的名贵补益类中药，主要含有苯乙醇苷、环烯醚萜苷、木脂素及甾醇等化学成分，其中，苯乙醇苷是肉苁蓉的主要活性成分，目前已从肉苁蓉属植物中分离得到30 余种此类单体成分。作者已对肉苁蓉的化学成分、质量控制、药理活性等进行了系统研究［4 － 8］。现采用酪氨酸多巴速率氧化法对肉苁蓉中的苯乙醇苷进行了酪氨酸酶活性的调控及动力

学特点的研究。

1 实验部分

1． 1 仪器与试药

酶联免疫检测仪( 美国Biorad) ; UV － 2550 紫外可见分光光度仪( 日本Shimadzu ) 。酪氨酸酶( 2. 35 × 103 U·mg － 1 ，美国Sigma) ; L － 酪氨酸( 天津光复精细化工研究所) ; 德赢vwin登录 药材采自新疆阿克苏地区阿瓦提县，鉴定为列当科植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schenk) Wight 的带鳞叶的肉质茎; 苯乙醇总苷( 自制) ; 熊果苷( 北京耐确生化技术研究所) ; 大孔吸附树脂( SP825 ) 、MCI 小孔树脂( 75 ～ 150 μm) ( 日本三菱) ; 水为重蒸水; 其余试剂为分析纯。

1． 2 方法与结果

1． 2． 1 苯乙醇总苷的制备称取德赢vwin登录 干燥肉质茎适量，粉碎后分别以3 倍量80% 乙醇回流提取3 次，合并滤液，减压浓缩后得乙醇浸膏，浸膏用适量水混悬，经大孔吸附树脂柱层析，依次以水、30%、50%、70%、95% 乙醇梯度洗脱，合并30% ～50% 乙醇洗脱馏份段，减压浓缩得浸膏，浸膏用适量水混悬，经MCI 小孔树脂柱层析，以H2O － CH3OH体系梯度洗脱，收集30% ～ 60% 的CH3OH 洗脱馏份段，减压浓缩至稠膏状，冷冻干燥，制成粉末，即得。用紫外分光光度法测定，苯乙醇总苷含量为48． 2% ，以HPLC 法测定，松果菊苷含量为27． 5%、毛蕊花糖苷含量为9． 6%。1． 2． 2 酪氨酸酶活性的测定采用酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性，以酶联免疫检测仪检测反应产物特异性吸光度( A490) 。反应在96 孔培养板中进行，总反应体系150 μL。取50 μL 测试物，加入50 μL 酪氨酸，待充分混匀后在冰浴中迅速加入50 μL( 25 U) 酪氨酸酶，混匀，在25 ℃ 下温育15 min，立即置酶标仪下测定每孔的A490。每组平行试验5 次。酪氨酸酶抑制率I = ［( A － B) － ( C －D) ］/ ( A － B) × 100% ，其中，A 为未加总苷而加酶的混合液吸光度，B 为未加总苷亦未加酶的混合液吸光度，C 为加入总苷和酶的混合液吸光度，D 为加入总苷而未加酶的混合液吸光度。

1 ． 2 ． 3 统计学处理计量资料以珋x ± s表示，数据采用SPSS 16． 0 统计软件进行分析。

1． 2． 4 苯乙醇总苷对酪氨酸酶活性的影响不同浓度的苯乙醇总苷对酪氨酸酶均有不同程度的抑制作用，抑制率的大小在一定浓度范围内( 0． 5 ～ 2． 0mg·mL － 1 ) 与效应物呈剂量依赖关系，标准曲线为:Y = － 0． 054X + 0. 459 ( r = 0． 9982) 。表现为在相同底物浓度条件下，苯乙醇总苷对酪氨酸酶抑制作用随浓度增大而增加。与空白对照组相比，1． 0 mg·mL － 1 熊果苷组和1． 0 mg·mL － 1 苯乙醇总苷组均有显著性差异( P ＜ 0． 05) ，苯乙醇总苷( 1． 5 ～ 3． 0 mg·mL － 1 ) 组则有极显著性差异( P ＜ 0． 01) ( 表1) ，说明苯乙醇总苷具有抑制酪氨酸酶活性的作用。

1． 2． 5 苯乙醇总苷抑制酪氨酸酶的动力学考察在不同浓度的酪氨酸底物溶液中，分别测定不同浓度苯乙醇总苷的A490，绘制Lineweaver － Burk 双倒数曲线( 1 /A ～ 1 / S) ，结果见表2。

苯乙醇总苷的Lineweaver － Burk 双倒数方程显示: 在一定浓度内，效应物的纵坐标截距基本固定( 2． 15 ～ 2． 43) ，表明苯乙醇总苷作为酪氨酸酶抑制剂并不改变酶促反应的最大反应速度，只能引起米氏常数( Km) 的改变，说明抑制剂与底物和酶的结合是互相竞争的，增加底物浓度可降低抑制剂对酶的效应，提示苯乙醇总苷对酪氨酸酶为竞争型抑制。

1． 2． 6 苯乙醇总苷对酪氨酸酶作用类型的判别绘制苯乙醇总苷对酪氨酸酶抑制作用的A － E 曲线，回归方程为: Y = 0． 024X + 0． 288 ( r = 0. 97 ) ，提示苯乙醇总苷对酪氨酸酶为可逆性抑制( 表3) 。

2 讨论

上世纪九十年代日本资生堂化妆品株式会社开发了高效、低毒的酪氨酸酶抑制剂—熊果苷，故实验选择熊果苷作为阳性对照药物。苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉的主要活性成分，在抗衰老、抗疲劳、补肾助阳、治疗老年性痴呆症等方面显示了较强的生理活性。实验研究结果表明: 苯乙醇总苷能够有效下调酪氨酸酶的活性，具有抑制黑色素生成的作用。为肉苁蓉在天然美白化妆品领域的开发应用价值提供了理论依据，有助于拓展肉苁蓉属资源的应用范

围。研究表明: 在皮肤黑素的生物合成过程中，超氧自由基起着引发作用，而氧的存在又可以加快黑素的合成速度。苯乙醇苷类化合物具有还原性酚羟基结构片断，由此推断苯乙醇苷对酪氨酸酶的抑制作用可能是通过拮抗氧对酪氨酸酶的激活和( 或) 清除超氧自由基从而终止自由基链的引发来实现的。

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