摘要: 目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( CPhGs) 抑制血小板衍生生长因子-BB( rrPDGF-BB) 介导的大鼠肝星状细胞( HSC)增殖活化作用及对PDGF/EＲK1 /2信号通路表达的影响。方法培养HSC 细胞，体外给予不同浓度( 0、3. 91、7. 81、15. 63、31. 25、62. 50、125. 00、250. 00 和500. 00 mg·L － 1 ) 的CPhGs 测定半数抑制率( IC50) ，选取25、50、75、100 mg·L － 1的CPhGs，rrPDGF-BB 刺激后，通过四甲基偶氮唑盐法( MTT) 检测细胞的增殖; 采用荧光定量PCＲ( ＲT-PCＲ) 检测EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen I mＲNA 的表达; 进一步采用Western blot 法检测CPhGs 对PDGF/EＲK1 /2通路中EＲK1 /2、P-EＲK1 /2和Collagen I 蛋白的表达。结果( 50 ～100) mg·L － 1 的CPhGs 可以抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 的增殖( P ＜ 0. 05) ; ( 25 ～ 100) mg·L － 1 剂量组的CPhGs 均可抑制EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 水平的表达，并且明显抑制EＲK1 /2、P-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ通路蛋白的表达。结论CPhGs 的抗肝纤维化作用可能与其阻断PDGF/EＲK1 /2通路进而阻断HSC 的活化、增殖有关。

关键词: 肉苁蓉苯乙醇总苷; 血小板衍生生长因子; 肝星状

细胞; 肝纤维化; 细胞增殖; 信号通路; 作用机制肝纤维化是慢性肝病发展为晚期肝硬化的中间环节，由细胞外基质( extracellular matrix，ECM) 合成与降解失衡所致，已成为肝病死亡的主要原因［1］。纤维化ECM 产生于肌成纤维细胞( myofibroblast，MFB) ，MFB 主要来源于活化的肝星状细胞( hepaticstellate cells，HSC) ［2 － 3］; 因此，抑制HSC 的激活，减少其增殖、活化是有效阻断肝纤维化发生、发展进程的重要途径，对预防肝硬化［4］、逆转肝纤维化的病程［5］具有重要的意义。肉苁蓉( Cistanche) 是列当科肉苁蓉属，一种在沙漠树木梭梭根部的寄生植物，中国传统的名贵中药材，其主要成分中苯乙醇总苷( phenylethanol glycosides from cistanche tubulosa，CPhGs) ［6］系发挥药效的主要物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物活性。前期研究显示，CPhGs对牛血清白蛋白( bovine serum albumin，BSA) 所致肝纤维化大鼠具有一定的防治作用［7 － 8］，血小板衍生生长因子( PDGF) -BB 已被证实在刺激HSC 生长和相关细胞间信号传递方面较为重要，本研究旨在观察CPhGs 在rrPDGF-BB 诱导的HSC 细胞增殖中的作用及其对EＲK 信号转导通路的影响。

1 材料与方法

1． 1 试剂与仪器肉苁蓉苯乙醇总苷: 德赢vwin登录 取自新疆吐鲁番地区，物种标本凭证存放于新疆省中药研究所，CPhGs 由新疆维吾尔自治区药物研究所植物化学室提取纯化，纯度为70%，以含10% 胎牛血清的DMEM( 高糖) 培养液配成不同浓度的混悬液，经0. 22 μm 滤器过滤后使用; 大鼠HSC 购自武汉Procell 生物科技有限公司; Ｒecombinant ratPDGF-BB 购自Peprotech 公司; EＲK1 /2、α-SMA、β-actin 引物委托上海生工生物工程服务有限公司设计，经Genbank 核实后合成; cDNA 反转录试剂盒购自Thermo scientific 公司; 荧光定量PCＲ( real-timePCＲ，ＲT-PCＲ) 试剂盒购自QIAGEN GmbH 公司; β-actin 单克隆抗体购自武汉Proteintech 公司; p44 /42

MAPK( EＲK1 /2) Antibody 和Phospho-p44 /42 MAPK( EＲK1 /2) Antibody 购自Cell signaling technology 公司; Collagen Ⅰ( ab34710) 抗体购自Abcam 公司; 碱性磷酸酶标记的二抗购自于美国Invitrogen 公司;

ＲIPA 裂解液购自于Thermo Fisher Scientific 公司。

1． 2 HSC 的培养和传代和半数抑制率( IC50)HSC 常规复苏后，用含10% 的胎牛血清的DMEM( 高糖) 完全培养液，在37℃、5% CO2及饱和湿度下培养; 当细胞呈单层致密状时，常规胰蛋白酶消化传代，24 h 换液，72 h 再传代; 实验选用对数生长期细胞，以5 × 104·L － 1 接种于96 孔板，24 h后换液，

加入不同浓度组( 0、3. 91、7. 81、15. 63、31. 25、62. 50、125. 00、250. 00 和500. 00 mg · L － 1 ) 的CPhGs，每组4 个复孔，作用48 h，MTT 法于酶标仪490 nm 测定吸光度A 值并取均数，计算IC50。

1． 3 MTT 法检测CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激HSC 增殖影响实验分组为空白对照组、rrPDGFBB刺激组、PDGF-BB + 不同终浓度( 25、50、75、100mg·L － 1 ) CPhGs 给药组。另设与试验平行不加细胞只加DMEM 培养液的空白组。rrPDGF-BB 的终浓度为10 ng·L － 1，每组4 个复孔，分别在加药后24、48、72 h 后进行MTT 法检测HSC 的增殖抑制作用。抑制率/% = ［( A 模型组－ A 空白组) － ( A 用药组－ A 空白组) ］/( A 模型组－ A 空白组) ×100%。

1． 4 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 表达的影响收集各组细胞，提取细胞总ＲNA，cDNA 合成参照公司的逆转录试剂盒合成。引物的设计及合成: 由上海生工生物有限公司采用引物设计软件Batch Primer 3 设计，经Genbank 核实后合成。引物序列见Tab 1。

反应条件: 94℃变性3 min，变性94℃ 30 s，退火30 s，延伸72℃ 45 s，循环30 次，终末延伸72℃10 min，其他步骤按说明书进行操作。以β-actin 为内参，以目的基因与β-actin 的比值表示目的基因mＲNA 的相对表达量( 2 － ΔΔCt ) 。

1． 5 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC p44 /42MAPK ( EＲK1 /2) 、Phospho-p44 /42 MAPK ( PEＲK1/2) 和Collagen Ⅰ蛋白表达的影响细胞分组同上。ＲIPA 裂解液裂解细胞，4℃ 12 000 × g 离心收集上清液，BCA 法测定蛋白含量，加4 × loadingbuffer 煮沸蛋白，上样蛋白量30 μg，制备10% 的SDS-PAGE 凝胶进行电泳。100 V 恒压转膜70 ～100 min，用10% 脱脂奶粉封闭1 h。一抗为兔抗p44 /42 MAPK( EＲK1 /2) antibody 和Phospho-p44 /42MAPK ( EＲK1 /2) antibody ( 1 ∶ 1 000 ) 及β-actin( 1 ∶ 5 000) 单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的抗兔抗体( InvitrogenTM) ，显色剂显影，GEL DOC XＲ凝胶成像系统分析结果。

1． 6 统计学方法应用SPSS 16. 0 统计软件分析数据。结果以珋x ± s 表示，组间比较用单因素方差分析及Tukey’s 法; Probit 进行HSC IC50分析。

2 结果

2． 1 CPhGs 对HSC 的IC50由Fig 1 可知，随着CPhGs 药物浓度的增加，HSC 的抑制率逐渐增加，CPhGs 在500 mg·L － 1浓度时，抑制率达到73. 4%，采用Probit 分析，计算CPhGs 药物的IC50为119. 125mg·L － 1。

2． 2 不同浓度、不同时间CPhGs 对rrPDGF-BB诱导HSC 细胞的增殖抑制作用与正常对照组比较， rrPDGF-BB( 10 ng·L － 1 ) 组的HSC 细胞明显增加，其中以48 h 增殖最为明显( P ＜ 0. 01) ，提示模型构建成功; 与rrPDGF-BB 组比较，除25 mg·L － 1 的CPhGs 对HSC 的抑制作用在24 h 及48 h 作用不明显以外，余CPhGs 组均能不同程度地抑制rrPDGFBB诱导的HSC 的增殖，差异有统计学意义( P ＜0. 05) ，其中rrPDGF-BB + CPhGs 100 mg·L － 1 剂量组的抑制率最高达47. 20%; 以抑制率表现最佳的CPhGs 100 mg·L － 1进行药物作用时间的考察，CPhGs

作用于细胞48 h 较24 h 时抑制率明显增加，但48 h后抑制率增加逐渐平缓，72 h 时抑制率最佳。说明CPhGs 发挥作用的最佳时间为rrPDGF-BB 刺激HSC 细胞48 h，后续时间，CPhGs 的抑制率增加趋于稳定，见Tab 2。

2． 3 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 表达的影响ＲT-PCＲ 检测EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ及β-actin 基因表达，25 ～ 100 mg·L － 1浓

度的CPhGs 均可不同程度地下调细胞EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen I 的mＲNA 表达，结果显示: 与正常对照组比较，在rrPDGF-BB 组EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 的表达水平

( P ＜ 0. 05) 明显增高; 与rrPDGF-BB 组比较，CPhGs不同浓度药物组的EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 表达强度均有所下降( P ＜0. 05) ，差异有统计学意义( Fig 2) 。

2． 4 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ蛋白表达的影响如Fig 3所示， rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ蛋白表达较正常组明显增加，CPhGs( 25、50、75、100 mg·L － 1 ) 给药组均可不同程度地抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和CollagenⅠ蛋白表达，其中以CPhGs100 mg·L － 1 给药组作用效果最为明显。

3 讨论

PDGF 主要源于血液中的血小板、肝窦内皮细胞、HSC、单核细胞、肝库普弗细胞等［9］。PDGF 包括-AA，-AB，-BB 3 种亚型，其中PDGF-BB 主要位于肝脏，促HSC 增殖的作用也最强，能促进HSC 活化增殖、胶原分泌，是目前已知的促HSC 增殖的细胞因子和促有丝分裂原; 病理条件下静止的HSC 表型会被激活，在肝纤维化进程中扮演着重要角色，能促使肝内的细胞－ 细胞、细胞－ 基质、基质－ 介质间相互作用，在复杂的网络系统中，促使细胞大量增殖;合成并分泌以胶原为主的ECM 和细胞因子、表达α-SMA、多种细胞因子及其受体、同时具有收缩功能。因此抑制rrPDGF-BB 对HSC 的生物学作用对防治肝纤维化有重要的意义。EＲK1 /2可被多种癌基因产物激活后向核内传递信号，磷酸化和活化核内的效应分子，调节下游核转录因子的表达，如c-myc、c-fos、c-jun、cyclin-D1、Bcl-2 等，最终启动与调节细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理过程相关的靶基因转录，发挥促进细胞的增殖、浸润、转移与恶性转化的功能［10］。c-fos 和c-jun 在成人正常组织中低表达，而在许多恶性肿瘤及其癌前病变中出现过度表达［11 － 12］。提示c-fos 和c-jun 的激活是细胞由正常状态向疾病状态转化的

一个重要的生物学标志［13］。ＲT-PCＲ 扩增检测EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ mＲNA 研究结果提示，PDGF /EＲK1 /2信号通路被激活，CPhGs 可能通过阻断PDGF /EＲK 信号通路中EＲK1 /2、c-fos、c-jun、α-SMA、Collagen Ⅰ mＲNA 表达而起到治疗肝纤维化的作用。所以rrPDGF-BB 作为一种损伤因素参与到肝纤维化的过程中，防治肝纤维化的重要

途径之一是阻断rrPDGF-BB 对HSC 的生物学作用。有研究［14 － 15］发现HSC 中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达与EＲK1 /2有关，抑制HSC EＲK1 /2的活化或表达后，

Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达将被抑制，EＲK1 /2的表达随着肝纤维化的进展而明显增加，且与α-SMA 的分布正相关［16］。因此以CPhGs 作为干预药物，观察CPhGs对rrPDGF-BB 刺激的HSC 增殖活性、Ⅰ型胶原、EＲK1 /2

与α-SMA 表达的影响，可能成为CPhGs 治疗肝纤维化的作用靶点。本研究结果显示，50 ～ 100mg·L － 1 浓度的CPhGs，对rrPDGF-BB 刺激的HSC增殖活性具有明显的抑制作用，除25 mg·L － 1 浓度的CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2 mＲNA的表达无明显差异外，其余浓度组的CPhGs EＲK1 /2及α-SMA mＲNA 的表达均有明显抑制作用，对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ蛋白表达也具有抑制作用，随CPhGs 浓度的增加抑制作用增强。

肉苁蓉作为一种名贵的中药材，在推动新疆特色沙漠产业的发展中具有重要地位; 本研究对CPhGs 药物的抗肝纤维化作用及机制进行研究，显示CPhGs 能够阻断PDGF 介导的HSC 的活化及增殖作用，同时抑制胶原纤维蛋白的分泌，这可能是通过CPhGs 药物干扰PDGF /EＲK 信号级联系统的相关信号分子及其磷酸化水平、抑制PDGF 诱导的HSC 活化和增殖来实现的。

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