杨杰，白雪，肖海涛，张一，刘昌福，吴文利，郝小燕”

（贵阳医学院药学院，贵州 贵阳550004）

摘 要：目的：研究中药肉苁蓉中异麦角器苷标准品的制备及含量测定方法。方法：采用微晶纤维素色谱与半制备高效液相色谱组合分离技术，分离纯化异麦角福苷，采用筹层色谱法和高效液相色谱面积归一化法检测纯度波谱法鉴定其结构，反相高效液相色谱法测定其含量，结果；制备的化合物鉴定为异麦角留苷，纯度为98.6％；含量测定在0.218～1.308g，里良好线性关系，r＝0.9995，平均回放率为102.8％．RSD为2.60％，n＝6，结论：该制备方法效率高，所得化合物纯度高，可用于大量制备；含量测肉苁蓉，定方法准确，简便，可靠，重复性好。

           关键词：肉苁蓉：异麦角福苷：半制备高效液相色谱法：反相高效液相色谱法：含量测定

肉苁蓉（Herba Cistanches）为列当科肉苁蓉 Cistanchedeserticola Y-C-Ma的干燥带鳞叶的肉质茎，因其生长在干旱荒漠中，又有补精益髓、壮阳润肠之功效，故有“沙漠人参”之美称，其主要活性成分为苯乙醇苷类化合物。近代药理学研究表明，肉苁蓉具有广泛的免疫调节、抗氧化、增强体力、抗疲劳”等药理作用，在防治神经退行性疾病上具有较好的应用价值。2005年版中国药典及成方制剂中均采用松果菊苷为对照品进行评价”，本课题组研究发现，肉苁蓉中的苯乙醇苷能上调a7尼古丁受体表达，具有较好的神经保护作用，其中异麦角甾苷是主要活性成分之一，因此，有必要对肉苁蓉中异麦角甾苷进行定性鉴别和含量测定。目前市场上还没有异麦角甾苷对照品的销售，并且也未见采用异麦角甾苷为对照品来评价肉苁蓉质量的报道。本文现将肉苁蓉中异麦角甾苷对照品的制备方法和含量测定方法报道如下。

1 仪器与试剂

X-4型显微熔点仪（国产，温度计未校正）：INOVA-400型核磁共振仪（TMS为内标）：HP 5973质谱仪（电离条件为70eV）：KQ-250B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），聚酰胺薄层层析板，高效薄层层析板（GF254，青岛海洋化工厂生产）；甲醇、乙睛为色谱醇，其他化学试剂均为分析醇，水为纯净水。

肉苁蓉药材采自新疆，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物的干燥肉质茎。

2 方法与结果

2.1 异麦角留苷的制备

取肉苁蓉粗粉3kg，用10倍量的水提取3次，每次2h，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.1（70～80℃）的清膏，在搅拌下加入乙醇，醇沉质量分数为70％，沉淀24h-取上清液，滤过。滤液回收乙醇并浓缩至相对密度约1.2（70～80℃）的清膏乙醇。取浸膏加水分散，用石油醚、乙酸乙酯，正丁醇分别萃取，回收溶媒得Rether萃取物（ASP）．E1OAc萃取物（ASE），nBuOH萃取物（ASB），余下水层回收溶媒后得H：0部分（ASW），E：OAc萃取物（ASE）上Sephadex LH-20．用氯仿一甲醇（1：1）洗脱，薄层点板跟踪，合并12～15流份，经微晶纤维素柱层析，用乙酸乙酯：甲醇：水（30：1：0.5）→（1：1：0.5）洗脱，合并第21～22流份得到异麦角甾苷粗提物0.42g。

2.2 色谱条件

2.2.1 制备HPLC 色谱条件 Waters 2475：SunFireTM-C18（10＃m，10x150mm）；柱温：室温；检测波长335nm；流动相：35％甲醇：流速：2.0mL／min。

2.2.2 分析HPLC色谱条件 HP1100：DiamonsilTM C18 柱（5m，250x4.6mm）：柱温：30℃：检测波长，335mm：流动相：乙腈-1％乙酸（20：80）：流速1.0mL／min。

2.2.3 异麦角留苷对照品的制备纯化 取异麦角甾苷粗

提物1.0g，用10mL甲醇超声溶解，过0.45Fm滤膜，备用，吸取1.0mL样品进半制备型高效液相色谱仪，收集保留时间所在的组分，减压回收溶剂，得异麦角甾苷粉末。

2.3 样品纯度检测及结构鉴定

2.3.1 薄层色谱检测 高效薄层层析板（GF254）。取本品加甲醇制成1mg／mL溶液，作为供试品溶液。采取上行展开方式，展距：8～10cm。3种展开剂系统：氯仿：甲醇：9％乙酸（10：3：0.5）；二氯甲烷：甲醇：9％乙酸（10：20.4）；乙酸乙酯：甲醇：9％乙酸（10：0.5：0.6）。定位后经紫外254nm、碘、FeCl溶液显色检视。结果显示经3个展开系统3种观察方式检识均呈单一斑点，未见杂质斑点。符合化学品要求。

2.3.2 紫外检测 取异麦角甾苷对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描，结果表明最大吸收波长为335mm，因此，确定335nm为测定波长。

2.3.3 面积归一化法 精密称取异麦角甾苷对照品（1mg／mL），按2.2.1，进样10L，样品显示为单峰，用面积归一化法计算含量为98.6％（保留时间为12.1min）·符合中药化学对照品含量测定用要求，结果见图1．

2.3.4 结构鉴定 灰白色粉末，UVs＝下显蓝色荧光．FeClK：［Fe（CN）］显蓝色。EI-MSm／z：624［M］，分子式为C＝HOs,'HNMR(400MHz,MeOH)8,1.24(3H.d.J= 6.5Hz,RhaCH),2.78(2H.m.H-7),4.36(1H.d.J= 8.0Hz,H-1'),4.39(1H.dd.J=12.0 Hz,6.0 H2,H-6'). 4.53(1H,dd,J=12.0 H2,1.5H.H-6'),5.17(IH.d.J= 1.5 Hz,Rha-1),6.30(1H,d,J=16.0 Hz,H-8"),6.53(1H. dd.J=8.0 Hz.2.0 Hz、H-6),6.65(1H,d.J=8.0 Hz.H 5).6.76(1H,d.J=2.0 H2.H-2),6.87(1H,d.J=8.0 Hz.d-J=2.0 Hz.H-2):7.57(1H.d.J=16.0Hz,H-7). "CNMR(100MHz-MeOH),130.6(Aglycone-1),116.4(Ag lycone-2),145.4(Aglycone-3),144.0(Aglycone-4),115.8 (Aglycone-5).120.4(Aglycone 6).71.1(Aglycone-A8).36.0 (Aglycone B7),127.0(Ester1),114.3(Ester 2),146.1(Es ter-3).149.0(Estert),115.7(Ester5),122.5(Ester-6). 114.1(Ester A8).145.4(Ester B7),168.4(Ester CO),103.7 (Gle-1).75.1(Gle-2).83.2(Gle-3).69.7(Gle-4),74.7(Gle 5).63.9(Gle-6),102.0(Rha-1),71.8(Rha-2).71.6(Rha-3), 73.3（Rha-4），69.4（Rha-5）．17.2（Rha-6）。分析以上数据符合文献报道的异麦角甾苷。

2.4 肉苁蓉药材中异麦角甾苷的含量测定

2.4.1 色谱条件与系统适应性实验 DiamonsilTC18柱（5／＇m．250x4.6mm）-柱温：30℃，检测波长，335mm，流动相：乙腈-1％乙酸（20：80），流速1.0mL／min。样品的理论塔板数均大于4000，分离度均大于1.5，说明该方法用于肉苁蓉样品异麦角甾苷的含量测定可行。

2.4.2 供试品的制备 称取肉苁蓉粗粉（过40目筛）约1g精密称定，置25mL容量瓶中，加入无水乙醇适量，称重，浸泡30min后，40℃超声提取30min．取出，补足减失重量，冷却，滤过，流动相定容至25.00mL，过0.45m滤膜，备用。

2.4.3 对照品溶液的制备 精密称取异麦角甾苷对照品0.0109g于10ml容量瓶中，用甲醇定容，得异麦角甾苷储备液，再从中取1.00mL于10mL容量瓶中，用流动相定容，得浓度为109＃g／mL的对照品标准溶液。

2.4.4 线性范围考察 分别精密吸取对照品标准溶液2、4,6,8,10,124．注入色谱仪，记录峰面积。以色谱峰积分面积为纵坐标（Y），异麦角甾苷的进样量为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y＝854.64X＋36.39，r＝0.9995．样品在0.218／g～1.308rg范围内线性关系良好。2.4.5 精密度实验 精密吸取同一对照品液5L，照前述色谱条件重复进样6次，测得异麦角甾苷面积积分值的RSD为0.34％，表明测定仪器精密度良好。

2.4.6 重现性试验 取同一批样品，按“供试品溶液的制备”方法，平行制备供试品溶液6份，按前述色谱条件进样20PL，测得峰面积并计算含量，结果异麦角甾苷的平均含量为0.91mg／g-RSD为2.54％，表明测定方法重现性良好。

2.4.7 稳定性实验 将同一份供试品溶液放置2,4,6.8h后，照前述色谱条件进样5PL，测得异麦角甾苷在8h内峰面积的RSD为3.60％，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。

2.4.8 回收率试验 取已知含量的样品约0.5g，共6份，精密称定，分别加入异麦角甾苷对照品2.180mg，按“供试品溶液的制备”方法制备，按前述色谱条件进样10FL，测得异麦角甾苷的平均回收率为102.8％，RSD为2.60％（n＝

表1 回收率试验      (n-6)

2.4.9 不同来源的肉苁蓉中异麦角锱苷的含量测定（见表2）

表2 不同来源肉苁蓉药材中异麦角甾苷的含量（a＝3）

3 讨论

肉苁蓉中的主要成分为苯乙醇苷类，它们是一类由苯乙基、咖啡酰基和若干个糖基组成的分子量较大的、结构彼此相似的水溶性成分，常含有羟基、甲氧基等取代基，这类化合物极性相近，完全通过依靠极性分离的硅胶柱难以将其完全分开，且在硅胶上有很强的吸附，使得含量本来就极低的此类化合物损失较大，同时苯乙醇苷类化合物分子内都含有两个或两个以上的糖基，糖苷类化合物难于结晶，纯化较困难。

目前，苯乙醇苷类化合物的分离多数采用的方法是先用大孔吸附树脂柱吸附，然后用硅胶柱反复层析，再用Sephadex LH-20纯化，此方法损失的目标物较多，并且浪费试剂。微晶纤维素是天然纤维素经稀酸水解并经一系

列处理后得到的葡萄糖的聚合体。由于微晶纤维素具有良好的物理和化学稳定性，对含糖基类的化合物吸附稳定，我们以微晶纤维素为层析介质分离纯化异麦角甾苷，再用制备液相法提纯异麦角甾苷，制备其标准品，方法简便易行，产品纯度好，成本低，适合异麦角甾苷对照品的大量制备。

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