【摘要】目的： 探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)及其单体(毛蕊花糖苷和松果菊苷)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖及凋亡的影响。方法：分别以含不同浓度(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 μg/mL)CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷的DMEM(高糖)完全培养液处理HSC-T6细胞48 h，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖情况并分别获得半数抑制浓度(IC )；再分50别用不同浓度受试物诱导HSC-T6细胞48 h，试验分为正常对照组，CPhGs(25、50、100 μg/mL)组，毛蕊花糖苷(1.5、3、6.0μg/mL)组及松果菊苷(125、250、500 μg/mL)组，流式细胞仪检测细胞凋亡的比例，Western blot检测细胞中凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果：CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞的增殖抑制率随着浓度的增加逐渐升高，IC 分别为119.1、7.0和520.3 50μg/mL；与正常对照组比较，3种受试物诱导HSC-T6细胞的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.01)，其中，CPhGs 100 μg/mL、毛蕊花糖苷6.0 μg/mL 及松果菊苷500 μg/mL浓度组的凋亡率分别为24.40%±3.16%，34.73%±1.16%和21.13%±0.98%；除毛蕊花糖苷1.5 μg/mL组外，其余不同浓度的受试物组均可引起HSC-T6细胞中Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调(Bcl-2/Bax比值降低)(P<0.05)。结论：CPhGs及其单体(毛蕊花糖苷和松果菊苷)可诱导HSC-T6细胞凋亡而抑制其增殖，从而起到抗肝纤维化的作用，3种受试物的抗肝纤维化效果排序为毛蕊花糖苷>CPhGs>松果菊苷。

【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；毛蕊花糖苷；松果菊苷；肝星状细胞；凋亡

肝星状细胞-T6 (hepatic stellate cells，HSC-T6)的[1-4] 活化是肝纤维化发生发展的关键环节，也是细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)的主要来源。目前认为，肝纤维化的形成，主要是由HSC-T6激活，ECM分泌过多、降解相对不足，胶原等ECM在肝内大量沉积所致。抑制HSC-T6的活化和增殖并诱导其凋亡已经成为肝纤维化治疗的重要理论依据。肉苁蓉属多年生根[5] 寄生的草本植物；肉苁蓉苯乙醇总苷(cistanchephenylethanoid glycosides，CPhGs)及其主要单体(毛蕊花糖苷、松果菊苷)具有良好的抗病毒、抑制炎症及调[6-8] 节细胞因子等多种生物功效，课题组前期研究表明， CPhGs对牛血清白蛋白(bovine serum albumin，[9-10] BSA)所致肝纤维化大鼠具有一定的防治作用。本研究进一步从体外实验探讨CPhGs及其单体(毛蕊花糖苷及松果菊苷)对HSC-T6细胞的增殖、凋亡及对B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)和Bax表达的影响，为进一步深入研究CPhGs 及其单体(毛蕊花糖苷及松果菊苷)治疗肝纤维化的作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

大鼠HSC-T6购自武汉Procell生物科技有限公司；CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷纯品由新疆维吾尔族自治区药物研究所提供，纯度分别为70%、98.89%和98.70%。胎牛血清购自美国Gibco公司， DMEM(高糖)培养基购自美国Hyclone公司，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)及二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，Bcl-2(ab7973)和Bax(ab7977)一抗购自美国Abcam公司， β-actin购自于武汉Proteintech 公司，碱性磷酸酶标记的二抗购自于美国Invitrogen公司， RIPA裂解液购自美国Thermo FisherScientific公司， 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自于美国Millipore公司。

1.2 CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷贮存液的配制用DMEM(高糖)完全培养液溶解CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷配制成浓度分别为5、1和20 mg/mL的贮存液，滤器除菌，使用时用完全培养液稀释至所需浓度。

1.3 分组及细胞增殖实验取对数生长期HSC-T6细胞， 调整密度为5×4 10 /mL，接种于96孔板中；细胞同步化后孵育24 h，依次加入含0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 μg/mL受试物的培养液，同步化孵育48 h后，MTT法用酶标仪检测吸光度D(490) 值，按下式计算细胞半数抑制率 (half inhibition rate，IC )。50每个浓度设4个复孔，实验重复3次。抑制率(%)=(1-各浓度平均吸光度值/空白组平均吸光度

值)×100％

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率实验分组为正常对照组， CPhGs(25、50、100μg/mL)组，毛蕊花糖苷(1.5、3、6.0 μg/mL)组及松果菊苷(125、250、500 μg/mL)组，每组设3个复孔。收集各6 组细胞，约为1×10 /mL，冷PBS缓冲液洗两次，弃上清，每管加入100 μL Annexin V结合缓冲液(主要成分包括：HEPES 10 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，CaCl 2.5 2mmol/L，NaOH调pH至7.4)，加入5 μL Annexin VFITC和5 μL PI，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，再分别加入400 μL Annexin V 结合缓冲液，1 h内上流式细胞仪检测。实验重复3次。结果判断标准：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示的是活细胞- - + + (FITC /PI )；左上象限是坏死细胞(FITC /PI )；而右下+ - 象限显现为凋亡细胞(FITC /PI )。

1.5 Western blot检测各药物组HSC-T6 细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达分组同1.4，取等量的蛋白质样品30 μg，电泳、转膜、5% BSA封闭，分别加入兔抗大鼠Bcl-2抗体(1∶100)、Bax抗体(1∶1 000)及β-actin抗体(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，显色剂显影， GEL DOC XR凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)扫描，GEL DOC软件分析结果。以β-actin表达水平作为内参照。实验重复3次。

1.6 统计学方法

应用SPSS for Windows 16.0统计软件进行分析。数据采用 x-±s 表示，多组间比较用单因素方差分析(OnewayANOVA)， 多组样本两两比较采用LSD法； 以α=0.05为检验水准。

2 结●果

2.1 CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞增殖的影响

与正常对照组比较， 随着受试物浓度(0~500μg/mL)的增加，不同浓度组的CPhGs、毛蕊花糖苷和松果菊苷作用48 h对HSC-T6细胞的增殖抑制作用逐渐升高， CPhGs (31.25~500 μg/mL)、毛蕊花糖苷(3.91~500 μg/mL)及松果菊苷500 μg/mL浓度组HSC-T6细胞活力逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。测得CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷的IC 分别为119.1、507.0和520.3 μg/mL，见图1。

2.2 流式细胞仪检测CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞凋亡的影响结果显示，正常对照组有少数细胞凋亡，与正常对照组比较，CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷不同浓度组的HSC-T6细胞均存在不同程度的凋亡，凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.01)；且随着受试药物浓度的增加，HSC-T6细胞的凋亡率逐渐增加，呈现一定的量效关系(r =0.980，P<0.01；r =0.891，P<0.01； CPhGs 毛蕊花糖苷r =0.834，P<0.01)。见图2。

2.3 CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响与正常对照组比较，CPhGs(50~100 μg/mL)组，毛蕊花糖苷(1.5~6.0 μg/mL)组及松果菊苷(125~500 μg/mL)组HSC-T6细胞中Bcl-2蛋白表达明显减少，差异均有统计学意义(P均<0.05)；CPhGs 100 μg/mL组、毛蕊花糖苷(1.5~6.0 μg/mL)组的Bax蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 不同浓度的CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷组对HSC-T6细胞Bcl-2 /Bax的比较与正常对照组比较，除毛蕊花糖苷1.5 μg/mL组外，其余受试物组HSCT6细胞的 Bcl-2/Bax比值明显降低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)，见表1。

3 讨●论

肝纤维化的发生发展是一个非常复杂的过程，他涉及多种细胞因子及信号转导通路之间的相互作用。肝纤维化是慢性肝病向肝硬化转化的病理学基础及必经之路，很大程度上影响着慢性肝病的后期[11] 治疗。因此对肝纤维化

的发展进程进行阻止或逆转，是医学界的一项热点课题。抑制HSC-T6活化、增殖、收缩，诱导其凋亡已成为理想的肝纤维[12] 化治疗方案之 一， 以HSC-T6细胞为靶点来研发抗肝纤维化药物已成为目前研究肝病治疗领域的

热点。

细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，它是以细胞遗传物质DNA的复制和细胞分裂为基本事件，本研究将CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)作用于体外培养大鼠的HSC-T6，结果显示各不同浓度的CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷均可抑制HSC-T6细胞增殖，光镜下可见HSC-T6细胞体积缩小，形态失去规则，提示CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6有体外抑制作用，随着受试物浓度的增高，HSC-T6的数量呈递减趋势，且抑制作用强度与药物浓度呈现明显的剂量依赖性(r =0.881，P<0.01； CPhGsr =0.923，P<0.01；r =0.802，P<0.01)，表明毛蕊花糖苷松果菊苷不同浓度的上述3种受试物均可以直接杀伤 HSC-T6。促进HSC-T6凋亡也是肝纤维化逆转的重要机制之一，本研究采用不同浓度的CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)作用于HSC-T6 48 h后，采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色检测HSC-T6细胞的凋亡，结果显示随CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷浓度的增加，HSC-T6的凋亡率逐渐增高，呈现一定的量效关系(r =0.980，P<0.01；r =0.891，P< 0.01； CPhGs 毛蕊花糖苷r =0.834，P<0.01)。流式细胞术结果显示，与正常松果菊苷对照组比较，CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷组的HSC-T6细胞明显向右上及右下象限移动，处于右上和右下象限之间，较接近中期凋亡。其中，CPhGs 100μg/mL浓度组的凋亡率为24.40％±3.16％，毛蕊花糖苷6.0 μg/mL浓度组的凋亡率为34.73％±1.16%， 松果菊苷500 μg/mL浓度组的凋亡率为21.13％± 0.98%，提示了各受试药物体外抗肝纤维化的最佳药物作用浓度；并显示出3种受试物的抗肝纤维化能力存在一定的差异，其抗肝纤维化的效果排序为毛蕊花糖苷

>CPhGs>松果菊苷。为了进一步阐明CPhGs、松果菊苷和毛蕊花糖苷防治肝纤维化差异的原因，我们对其化学结构进行了分析。苯乙醇苷具有明显的抗炎、抗[13] 菌、抗氧化、保肝等药理作用，两种单体成分的化学结构都具有苯乙醇苷化合物，差别在于毛蕊花糖苷(C29H36O15)为双糖苷，而松果菊苷(C35H46O20)为三糖苷，多出的糖苷使空间位阻变大，增大的空间位阻效应使得松果菊苷不易与自由基接近，因此其抗氧化能力相对较弱，对HSC活化的抑制剂保肝效果略弱于毛蕊花糖苷。细胞凋亡是一系列基因的激活、表达以及调控等[14-15] 作用的结果。本研究结果显示正常对照组的HSCT6高表达抗凋亡基因Bcl-2，促凋亡基因Bax呈现静止态，而CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷诱导HSC-T6的Bcl-2表达下降，促凋亡基因Bax表达增加，Bcl-2/Bax的比值下降，提示不同浓度的受试药物诱发HSC-T6细胞凋亡的机制可能是通过上调Bax蛋白，下调Bcl-2蛋白以及降低Bcl-2/Bax比值，促使线粒体通透性增加，从而引起Fas诱导的凋亡发生。本研究采用CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)干预大鼠HSC-T6细胞，发现这3种受试物均能抑制HSC-T6细胞的增殖，诱导其凋亡，并使凋亡相关蛋白的表达发生改变，显示CPhGs及其主要单体(松果菊苷和毛蕊花糖苷)成分具有显著的抗肝纤维化作用。其中，毛蕊花糖苷的效果最为显著，CPhGs活性介于两者之间，提示CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)可能具有抗肝纤维化药物的开发前景。

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