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肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对大鼠T6 肝星状细胞 凋亡的影响及作用机制研究 马

发布日期:2021-11-16 10:50:00

摘要: 目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( phenylethanol glycosidesfrom cistanche tubuiosa,CPhGs) 脂质体对大鼠肝星状细胞( HSC-T6) 凋亡的影响及其抗肝纤维化的相关分子机制。方法培养HSC-T6,取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验,采用重组大鼠血小板衍生生长因子BB( rrPDGFBB)刺激HSC-T6,构建体外肝纤维化模型。MTT 法测定CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72、7. 36 mg·L - 1 ) 对HSC-T6 增殖的影响; AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂标记后,流式细胞仪检测CPhGs 脂质体不同浓度组的细胞凋亡率; 实时荧光定量PCR( qRT-PCR) 检测α-SMA、Collagen I、CollagenⅢ mRNA 的表达水平; Western blot 法检测CPhGs 脂质体对p-JNK 蛋白表达的影响。结果不同浓度CPhGs 脂质体均可抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC-T6 的增殖; CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72 mg·L - 1 ) 组凋亡率明显升高; qRT-PCR 结果显示,CPhGs 脂质体不同浓度组均可下调α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mRNA 水平的表达,并能降低p-JNK 蛋白的表达。结论CPhGs 脂质体能抑制大鼠HSC-T6 的增殖并诱导其凋亡,其作用可能与抗肝纤维化有关。

关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇总苷; 肝星状细胞; 细胞凋亡; 脂质体; 肝纤维化

肝纤维化( hepatic fibrosis,HF) 是一种慢性的瘢痕形成与修复过程,是发病率和死亡率都很高的世界医学难题。HF 的特点是细胞外基质过度沉积,晚期HF 可诊断为肝硬化,并最终可能发展为肝衰竭,甚至肝细胞癌[1]。目前公认肝星状细胞( hepaticstellate cell,HSC) 的活化是HF 进展过程中的关键事件[2]。在HF 进程中,HSC 激活成肌成纤维细胞是瘢痕形成的关键环节[3 - 4]。中医具有治疗复杂疾病及相关疾病的功效,肉苁蓉( Cistanche) 是著名的名贵补益类中药,具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。课题组前期研究证实,肉苁蓉苯乙醇苷类化合物具有良好的保肝护肝作用,且其能引起Fas 诱导的HSC 凋亡[5]。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( phenylethanol glycosides from cistanche tubuiosa,CPhGs) 脂质体对HSC 凋亡的影响及其分子机制,通过靶向载药系统转运药物,来克服一些药物半衰期短、无法到达靶器官,或到达了但无法在其周围形成有效药物浓度等缺点,最大程度发挥药物疗效,达到长效、靶向及减轻药物副作用等目的,期望能寻求更多的可以应用于临床治疗HF 的靶向药物治疗途径,为HF 的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 细胞株大鼠HSC-T6 细胞株,购自上海中乔新舟生物科技有限公司,货号: ZQ0780。

1. 1. 2 药物与试剂用薄膜分散二次包封法制备pPB 修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体,其粒径为212. 7 nm,电位35 ~ 50 mV,包封率( 38. 46 ±7. 85) %,由本实验室保存。胎牛血清( 美国Gibco公司) ; DMEM 高糖培养基( 美国Hyclone 公司) ;MTT( 美国Sigma 公司) ; Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒( 美国BD 公司) ; TRIzol Reagent ( Lifetechnologies) ; RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit、RIPA 裂解液( 赛默飞公司) ; SYBR Premix ExTaqTMⅡ( TaKaRa 公司) ; 蛋白定量试剂盒( Biomiga公司) ; 重组大鼠血小板衍生生长因子BB( recombinantrat platelet-derived growth factor BB, rrPDGF-BB)( R&D 公司) ; 抗β-actin、JNK、p-JNK 多克隆抗体( 北京博奥森生物科技有限公司) 。

1. 1. 3 仪器超净工作台、全波长自动酶联免疫反应检验测试仪( 美国Thermo Scientific 公司) ; CK-40型荧光倒置显微镜( 日本Olympus 公司) ; 低温离心机( 美国Sigma 公司) ; Western blot 电泳装置及转膜装置( 美国Bio-Rad 公司) ; QuantStudio 6 Flex 型实时荧光定量PCR 仪( 美国ABI 公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞培养与传代HSC-T6 在含有100 kU·L - 1青霉素、100 mg·L - 1 链霉素和10% 胎牛血清的高糖DMEM 细胞培养液,于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞隔日换液,待生长融合至80% ~90% 时,使用0. 25% 胰蛋白酶消化收集细胞,按1 ∶ 2进行传代培养,所有实验采用对数生长期细胞。

1. 2. 2 细胞分组实验分为Normal 组、rrPDGF-BB组、rrPDGF-BB + CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72、7. 36mg·L - 1 ) 组。各组细胞均培养24 h 后,收集细胞进行后续实验。

1. 2. 3 MTT 法检测细胞增殖HSC-T6 以5 000个/孔密度接种至96 孔板,待细胞贴壁后进行分组干预,每组设3 个复孔。分别培养24、48、72 h,向每孔加入10 μL MTT 溶液,培养箱内37℃培养4 h 后,弃去MTT 溶液,再向各孔加入100 μL DMSO,置于摇床室温摇动10 min,待结晶充分溶解后,于酶标仪492 nm 波长处测定吸光度。

1. 2. 4 流式细胞术检测细胞凋亡取生长状态良好的对数生长期细胞,经胰酶消化后接种于6 孔板,每孔细胞数为1 ×105 个, 24 h 后按相应浓度加药,继续培养48 h 后,每孔加入500 μL 胰酶消化细胞,加完全培养液终止消化,吹打混匀移至15 mL 离心管,PBS冲洗细胞,1000 r·min - 1离心5 min。弃上清,加PBS冲洗细胞2 次,用AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂标记后,用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1. 2. 5 实时荧光定量PCR 检测α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mRNA 的表达TRIzol 试剂盒提取HSC-T6 总RNA,经纯度及完整性鉴定后反转录反应生成cDNA。按照实时荧光定量PCR 试剂盒说明书建立PCR 反应体系,使用实时荧光定量PCR 检测仪进行检测。PCR 热循环参数为: 95℃预变性30s,95℃变性5 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,共40个循环。结果分析以β-actin 为内参基因,确定每个样本、每个基因扩增的循环阈值( CT) ,按照2 -△△CT计算目的基因的相对表达量,所用引物序列见Tab1。

1. 2. 6 Western blot 法分析p-JNK 蛋白表达水平收集细胞,RIPA 细胞裂解液提取各组细胞总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度,取相同质量的蛋白上样,经SDS-PAGE 凝胶电泳转移至硝酸纤维素膜,5% 的脱脂奶粉室温封闭1 h,p-JNK、JNK 一抗( 1 ∶ 5 000 稀释) 4℃ 摇床孵育过夜,TBST 漂洗3 次,二抗( 1 ∶ 5 000) 室温孵育1 h,TBST 漂洗3 次后,化学发光显影试剂盒( ECL) 曝光显影。利用图像分析软件Image J 对条带进行灰度值的测定,计算分析各组蛋白相对表达量,以p-JNK 与JNK 条带信号强度的比值表示p-JNK 蛋白表达水平。

1. 3 统计学分析采用SPSS 17. 0 软件进行统计学分析,计量资料以珋x ± s 表示,多组间比较采用单因素方差分析,多组样本两两比较采用LSD 法。

2 结果

2. 1 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6增殖的影响Fig 1 的MTT 结果显示,在24 h时,与Normal 组比较, rrPDGF-BB 组OD 值明显增加( P < 0. 05) ; 与rrPDGF-BB 组比较,除CPhGs 脂质体7. 36 mg·L - 1组外,其余CPhGs 脂质体不同浓度组OD 值均明显下降( P < 0. 05 ) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L - 1组相比,CPhGs 脂质体29. 45 mg·L - 1组OD 值明显降低( P < 0. 05) 。在48、72 h 时,与Normal 组比较, rrPDGF-BB 组和CPhGs 脂质体不同浓度组OD值均明显增加( P < 0. 05) ; 与rrPDGF-BB组比较,CPhGs 脂质体不同浓度组OD 值明显下降( P < 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L - 1 组比较,CPhGs 脂质体( 14. 72、29. 45 mg·L - 1 ) 组OD 值明显下降( P < 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体14. 72 mg·L - 1组比较,CPhGs 脂质体29. 45 mg·L - 1 组OD 值明显下降( P < 0. 05) 。结果提示,随着药物浓度增大和干预时间的延长,CPhGs 脂质体各剂量组抑制

HSC-T6 增殖的作用呈现明显的剂量- 效应关系。

2. 2 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6凋亡的影响如Fig 2 所示,与Normal 组相比,rrPDGF-BB 组凋亡率下降( P < 0. 05) ; 与rrPDGF-BB组相比,CPhGs 脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升( P < 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L - 1 组比较,CPhGs 脂质体( 14. 72、29. 45 mg·L - 1 ) 组凋亡率明显上升( P < 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体14. 72 mg·L - 1组比较,CPhGs 脂质体29. 45 mg·L - 1 组凋亡率明显增高( P < 0. 05) 。结果显示,随着CPhGs 脂质体药物浓度的升高,HSC-T6 凋亡率也逐渐增高,CPhGs 脂质体各剂量组间呈现剂量- 效应关系。

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2. 3 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA 表达的影响如Fig 3 所示,与Normal 组比较,α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 在rrPDGF-BB 组表达明显增加( P < 0. 05 ) ; 与rrPDGF-BB 组比较,α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 在CPhGs 脂质体不同浓度组表达均下降( P < 0. 05) ; CPhGs 脂质体各剂量组间比较,可见随CPhGs 脂质体浓度增大,α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 表达明显下降,差异具有统计学意义( P < 0. 05 ) ,其中以CPhGs 脂质体29. 45 mg·L - 1组抑制效果最明显。

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2. 4 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6p-JNK 蛋白表达的影响如Fig 4 所示,与Normal组比较,p-JNK 蛋白在rrPDGF-BB 和CPhGs 脂质体不同浓度组表达明显增加( P < 0. 05) ; 与rrPDGF-BB 组比较,p-JNK 蛋白在CPhGs 脂质体不同浓度组表达下降( P < 0. 05) ; CPhGs 脂质体各剂量组间比较,p-JNK 蛋白随CPhGs 脂质体干预剂量增加表达明显下降,呈现剂量- 效应关系( P < 0. 05) ,其中以29. 45 mg·L - 1组效果最明显。

3 讨论

在慢性肝病中,HSC 的反复激活导致HF,其特征是广泛的瘢痕形成和干扰肝脏正常结构与功能[6]。目前,抗HF 的主要策略是抑制HSC 活化、增殖、收缩,诱导HSC 凋亡。HSC 的活化是HF 的主要过程[7],HF 主要是由于细胞外基质过度沉积所致,而活化的肝HSC是细胞外基质的主要来源。

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肝损伤后,HSC 经历一个复杂的从静止状态向肌成纤维细胞转换或激活过程,α-SMA 是HSC 活化的标志物,α-SMA 在肌成纤维细胞分化中起作用。α-SMA 降低了收缩力和Collagen I 合成,并抑制伤口收缩。Collagen I 和α-SMA 被认为是HF 中诱导HSC 活化的标志物,可以减少α-SMA 的含量,促进HSC 凋亡,逆转HF 进程。宋阳等[8]的研究结果证实,其研究的药物可明显抑制HSC 的增殖,促进其凋亡,并使α-SMA 蛋白表达明显降低,以此降低细胞外基质的沉积,从而起到逆转HF 的作用。由淑萍等[9]研究表明,肉苁蓉苯乙醇总苷可以抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 增殖。上述研究结果提示,抑制HSC 的激活和增殖,促进HSC 凋亡已成为阻止HF 发生、发展的关键事件。最近的临床实验证据也提示,HF 具有可逆性的[10]。HF 的逆转与HSC 的凋亡有着密切关联。HF 逆转期,活化的HSC 数量减少主要依靠细胞凋亡,而不是活化状态细胞向静止状态转化。细胞凋亡是细胞的主动“自杀”过程,与坏死不同,细胞凋亡发生于HF 的产生和发展过程中。HSC 凋亡在HF 发展过程中不仅起着主动作用,而且贯穿整个纤维化形成的过程。本研究用不同浓度的CPhGs 脂质体药物作用于HSC-T6 48 h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示,与Normal组相比, rrPDGF-BB 组凋亡率下降,CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72 mg·L - 1 ) 组凋亡率上升,与rrPDGF-BB 组相比,CPhGs 脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升,且CPhGs 脂质体不同浓度组相比,差异具有统计学意义。实验结果表明,CPhGs 脂质体可诱导HSC-T6 的凋亡,且凋亡程度与CPhGs 脂质体浓度存在联系,CPhGs 脂质体各剂量组间表现出明显的剂量- 效应关系。HF 是指结缔组织过度增殖和异常沉积,特别是胶原蛋白、非胶原蛋白和肝小叶门管区的蛋白多糖等。因此,细胞外基质降解和生成之间的不平衡是HF 发生与发展的关键因素。因此,保护肝细胞,促进肝再生,保持胶原蛋白的正常代谢也成为预防和治疗HF 的重要措施。人类有19 种胶原蛋白,在肝脏中存在的有5 种类型,在HF 的总蛋白中胶原蛋白约占50%,主要涉及Collagen I 和Collagen Ⅲ。在肝脏中,Collagen I 占60% ~ 70%,Collagen Ⅲ占

20% ~ 30%,是构成细胞外基质的主要成分。因此,Collagen I 和Collagen Ⅲ被认为是反映胶原蛋白在肝脏中进行新陈代谢的重要参数。李伟伟等[11]的研究结果显示所研究药物可通过抑制CollagenⅢ沉积而起到抗HF 作用。张扬武等[12]的实验结果也证实了可通过抑制HSC 的活化,降低Collagen I 的表达,达到逆转HF 的作用。本研究采用实时荧光定量PCR 检测α-SMA、Collagen I 和Collagen Ⅲ基因表达,研究结果显示,与Normal 组相比, rrPDGFBB组α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mRNA 表达明显增高,与rrPDGF-BB 组相比,不同浓度的CPhGs脂质体组均可不同程度下调α-SMA、Collagen I 和Collagen Ⅲ的mRNA 表达,其中29. 45 mg·L - 1CPhGs 脂质体组下调作用最明显,且随着药物浓度的升高,其下调程度越明显。我们认为产生这种现象的原因在于浓度越高,其对rrPDGF-BB 引起的HSC 增殖的抑制效果越明显,越趋近于正常。因此,我们认为其能抑制HSC 增殖,促进其凋亡,以此来阻止HF 的形成。JNK 已显示对不同细胞类型的细胞增殖有积极的调节作用,JNK 通过负性调节作用来抑制静止HSC 的活化,从而阻止HSC 的增殖,刺激MAPK 信号通路,从而使其下游通路阻断,起到预防HF 的作用。本研究结果显示,与Normal 组比较, rrPDGF-BB组p-JNK 的蛋白表达量明显增高,表明rrPDGF-BB可通过影响MAPK 信号,使HSC 活化增殖。不同浓度的CPhGs 脂质体组,p-JNK 的蛋白表达量随着药物浓度的升高逐渐降低,且不同浓度的CPhGs 脂质体组p-JNK 的蛋白表达量与rrPDGF-BB 组比较,差异均有统计学意义。由此可见,CPhGs 脂质体可在一定程度上抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 增殖与活化,促进HSC 凋亡,从而抑制HF 的发生、发展。本研究结果为后续实验进一步研究CPhGs 脂质体抗HF 作用机制提供了扎实的理论基础。期望能够寻求更多抗HF的靶向给药途径,给HF 患者带来福音。


参考文献:

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