1 材料与方法

1.1 材料

Hela 细胞（人宫颈癌细胞），购自上海细胞生物研究所：松果菊苷（echinacoside）由本实验室从荒漠肉苁蓉中分离纯化得到，经HPLC-ELSD检验，以松果菊苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111670）为对照，测得纯度为95.1％；毛蕊花糖苷（acteoside）由本实验室从荒漠肉苁蓉中分离纯化得到，经HPLC-ELSD检验，以毛蕊花糖苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111530）为对照，测得纯度为96.4％：质粒 ERa、ERβ、EREtue、Renila（本实验室提取）：雌二醇（E2），Sigma 公司：胎牛血清（FBS），PAA公司：活性炭处理胎牛血清（CS-FBS），PAA公司：无酚红DMEM.Sigma公司：二甲基亚砜（DMSO），Amresco 公司：LB培养基，上海生工生物科技公司：Passive Lysis 5X Buffer，Promega 公 司：Lipofectamine 2000．Promega 公司：质粒提取试剂盒，TIANGEN公司：荧光素酶报告基因检测试剂盒为Promega公司产品。

1.2 细胞培养

Hela细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。实验前至少提前一代换为含1％活性炭处理的胎牛血清的DMEM培养液。

1.3 转染及荧光素酶活性测定

将Hella细胞以70％～80％密度接种到24孔板，待细胞贴壁后，细胞密度为90％时，按照 lipo-fectamine2000转染试剂说明转染ERa、ERβ表达质粒和ERE、Renila报告质粒，8h后换液并加入不同浓度的受试药物，培养过夜后，用多功能读板机分别检测雌激素应答元件ERE荧光素酶的活性，计算药物对荧光素酶活性的相对影响。

1.4 数据处理和统计学分析

采用SPSS18.0统计软件，数据以平均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较：检验对数据进行分析，P＜0.05被认为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 毛蕊花糖苷对雌激素应答元件ERE荧光素酶活性的影响

结果显示，由ERa、ERβ介导时与对照组相比，E2110nmol）能显著上调雌激素应答元件ERE荧光素酶活性，毛蕊花糖苷在10、100、1、10、50 μmol时均能上调雌激素应答元件ERE荧光素酶活性，当浓度达到50μmol时对ERE荧光素酶活性的上调作用与雌二醇相当，且有计量依赖性，但是对雌激素受

体ERa、ERβ的选择性不明显（图2）。

图2 毛蕊花糖苷以浓度依赖方式对ERE荧光素酶活性的影响

Fig.2 Effects of different concentrations of acteonide on the Inciferase activity of ERE

注：与对照维比较，P＜0.05与E组比较．P＜0.05．n＝4

Nate: comprnd wih conted grp.P<0.05.ompared wih E gmup-P<0.05:m=4

2.2 松果菊苷对雌激素应答元件 ERE荧光素酶活性的影响

结果显示，由ERa、ERβ介导时与对照组相比，E2（10nmol）能显著上调雌激素应答元件ERE荧光素酶活性，松果菊苷在10、100、1、10、50 μmol 时均能上调雌激素应答元件ERE荧光素酶活性，当浓度达到50μmol时对ERE荧光素酶活性的上调作用略低于雌二醇，且也有计量依赖性，但是对雌激素受体ERa、ERβ有微弱的选择性差异（图3）。

图3 松果菊苷以浓度依赖方式对雌激素应答元件 ERE荧光素酶活性的影响

Fig 3 Efects of different concentrations of echinacoside on the haciferase activity of ERE

注与对照组比较，P＜0.05与E2组比较，P＜0.05：n＝4Note mmpund wih mntral gruup.P<0.05 cumpured with E pap,P<0.05.n=4

2.3 毛蕊花糖苷和雌二醇对雌激素受体的竞争性结合作用

结果显示毛蕊花糖苷能与雌二醇竞争性结合雌激素受体，拮抗雌二醇对雌激素应答元件ERE荧光元件ERE的荧光素酶活性，且毛蕊花糖苷表现出剂量依懒性，当浓度达到50μmol时对雌二醇的拮抗作用素酶活性的上调作用。与E2（10nmol）组相比，毛蕊花糖苷在1、10、50 μmol时均能不同程度的下调雌二醇对雌激素应答最明显（图4）。

图4 毛蕊花糖苷以剂量依赖方式拮抗雌二醇对雌激素应答元件ERE荧光素酶活性的影响

Fig.4 Acteoside can stop estradiol to up mgulation the lu-cifease activity of ERE

注：与对照组比较，P＜0.05：与E组比较．P＜0.05．m＊4Nate companel wih tl gpP<0.05.ompard wih E map.P<0.05.n=4

2.4 松果菊苷和雌二醇对雌激素受体的竞争性结合作用

结果显示松果菊苷同样能与雄二醇竞争性结合雌激素受体，拮抗雌二醇对雌激素应答元件ERE荧光素酶活性的上调作用。与E2（10nmol）组相比，毛蕊花糖苷在1、10.50μmol时均能不同程度的下调雌二醇对雌激素应答元件ERE的荧光素酶活性，且松果菊苷表现出剂量依懒性，当浓度达到50μmol时对雌二醇的拮抗作用最明显（图5）。

图5 松果菊苷拮抗练二醇对雄激素应答元件ERE荧光素酶活性的影响

Fig 5 Echinacuside can stop estradiol to up replation the Inciferase activity of ERE

注：与对照组比较，P＜0.05：与E组比较，P＜0.05m＝4Nate: compamd with contel guup.P<0.05 mpand wih E moup-P<0.05.n=4

3 讨论

本实验首次通过明确数据显示肉苁蓉中主要有效成分松果菊苷和毛蕊花糖苷能结合雌激素受体ERa、ERB.上调ERE的荧光素酶活性而发挥雌激素作用，表现出SERMs活性。对上述实验数据进行分析后表明，在ERa体系中毛蕊花糖苷在50μmol时对雌激素应答元件ERE荧光素酶活性的上调作用相当于E2（10mmol）时的0.977倍，在ERβ体系中相当于0.970倍：同样，在ERa体系中松果菊苷在50 μmol时对雌激素应答元件ERE荧光素酶活性的上调作用相当于E2（10nmol）时的0.874倍，在ERβ体系中相当于0.937倍，固毛蕊花糖苷对对雌激素应答元件ERE荧光素酶活性的上调作用略微高于松果菊苷，且对雌激素受体ERa、ERB的选择性不明显，而松果菊苷对雌激素受体ERa、ERβ有微弱的选择性差异，这些差异可能和毛蕊花糖苷和松果菊苷的R4位连接的基团不同有关。

维激素主要通过雌激素受体发挥作用，维激素受体主要有两种亚型ERα、ERB，雌激素和有雌激素作用的物质和雌激素受体结合形成二聚体，然后二聚体与雌激素应答原件ERE结合，进而发挥雌激素效应口m。植物雄激素和维激素具有相似的结构和功能。，研究表明植物雌激素能调节骨代谢，对于维持骨吸收和骨形成的平衡具有极其重要的作用，对老年性机能减退患者的骨质疏松有一定的临床防治作用。故推测肉苁蓉促进骨再生、抑制妇女绝经后期骨质疏松形成的作用是通过其植物雌激素作用而发挥疗效的。

本实验还表明松果菊苷和毛蕊花糖苷能与雌二醇竞争性的结合雌激素受体，拮抗雌二醇对ERE荧光素酶活性的上调作用，此作用机制和白藜芦醇等已知植物雌激素成分作用相似。进一步说明松果菊苷和毛蕊花糖通过结合雌激素受体ERa、ERB而发挥雌激素作用。

上述对肉苁蓉的植物雌激素活性及其发挥雌激素作用机理的研究，为肉苁蓉可能通过改善机体雌激素水平发挥延缓、抑制妇女绝经后期骨质疏松的形成或者治疗由于机体雌激素水平下降而引起的骨质疏松提出了可能，为扩大肉苁蓉的临床药用范围提供了理论依据