1 实验部分

1.1 实验仪器

H、H、S、21-型电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）：TG328A 电光分析天平（上海天平仪器厂）：40目筛子（浙江宏兴仪器厂）KQ-250B型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；索氏提取器（浙江宏兴仪器厂）：766-2型远红外辐射干燥（上海阳光仪器有限公司）：HX-200A型高速中药粉碎机（浙江永康溪岸五金药具厂）；TU-1201型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）：PHS-3C精密数显酸度计（上海天达仪器有限公司制造）；荧光分光光度计（VARIAN）。

1.2 实验试剂与药品

肉苁蓉（实验室提供）：无水乙醇（分析纯）（沈阳市新化试剂厂：芦丁（标准品）（实验室提供）：50g／L亚硝酸钠溶液（自制）：100gL硝酸铝溶液（自制）；40gL氢氧化钠溶液（自制）：pH＝6.5的混合磷酸盐溶液：0.1mol／L磷酸氢二钠，0.1mol／L磷酸二氢钾：苯甲酸溶液：0.4000g苯甲酸（AR沈阳试剂厂），用pH＝9.5的混合磷酸盐溶液溶解后，用水稀释定容至100mL，避光保存备用：Cu溶液：1.0x10g／mL；过氧化氢（AR，沈阳第一试剂厂）：30％：0.1mol／L混合磷酸盐（磷酸氢二钠，AR，沈阳市新城化工厂；磷酸二氢钾，AR，沈阳市合富化学试剂经销）溶液：水为二次蒸馏水。

1.3 肉苁蓉中总黄酮类化合物的提取

1.3.1肉苁蓉中黄酮类化合物的提取（超声波法）精确称取2.0000g（过40目筛）的肉苁蓉放入

100mL锥型瓶中，在常温下，按固液比1：15，加入95％的乙醇试剂，进行超声提取，每次进行超声震荡30min之后进行抽滤，将滤渣回收，再加入95％的乙醇试剂进行超声震荡，抽滤，超声提取3次，合并3次滤液，得到所需的提取物，加入95％的乙醇试剂定容于100mL容量瓶中，备用。

13.2 肉苁蓉中黄酮类化合物的提取（索氏提取法）

精确称取10.0000g（过40目筛）的肉苁蓉，用脱脂滤纸包好，一端扎好，放入索氏提取器的提取管内，将提取剂95％的乙醇试剂加入到提取瓶中约为容积的1／2，然后安装索氏提取器，用略高于提取剂（乙醇）沸点的恒温水浴进行索氏提取4h，之后冷却，进行旋转蒸发，浓缩，用95％的乙醇试剂定容于100mL的容量瓶中，备用。

1.3 提取物质含量的测定和回收率实验

1.3.1 含量测定及回收率实验

取6个25mL的容量瓶，从用超声法提取的肉苁蓉样品液中吸取0.10、0.20、0.30mL于前3个容量瓶中，后3个容量瓶中加入同样多的样品液，然后分别加入1.0mL的芦丁标品液，向这6只容量瓶中依次加入50gL的亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置7min；加入100g／L硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置7min：加入40g／L氢氧化钠溶液10mL，同样摇匀静置7min：用95％的乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，静置15 min：以加显色剂的空白液为参比，在503nm 处测定吸光度A，通过标准曲线计算出浓度C.

表1 肉苁蓉中黄酮类化合物的含量

取6个25mL的容量瓶，从用索氏提取法提取的肉苁蓉样品液中吸取15mL重新定容于100mL容量瓶中，在其中移取 0.40、0.50、0.60mL 于前3个容量瓶中，后3个容量瓶中加入同样多的样品液，然后分别加入1.0mL的标品液，加入50gL的亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置7min：然后加入100g／L硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置7min：再加入40gL氢氧化钠溶液10mL，摇匀，静置7min；用95％的乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，静置15min，以其空白液为参比，在503nm处测定吸光度A，通过标准曲线计算出浓度C.

13.2 稳定性实验的测定

移取样品液0.2mL 依次加入显色剂50gL的亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置7min：加入100gL硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置7min；加入40g／L氢氧化钠溶液10mL，同样摇匀静置7min；用95％的乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，静置15min；以加显色剂的空白液为参比，然后用紫外可见分光光度计进行测定，时间设置2h，结果发现样品液吸光度在2h内很稳定基本保持不变。

表2 肉苁蓉中黄酮类化合物的含量

1.4 肉苁蓉中黄酮类化合物抗氧化性的分析催化动力学荧光法测定中草药对羟基自由基的清除率

1.41 实验方法

在一系列25mL的比色管中加入苯甲酸溶液，再依次加入一定量的Co和过氧化氢，用pH＝6.5的混合磷酸盐溶液稀释定容至25mL，摇匀，于沸水浴中放置45min后测定各溶液的荧光强度。

中草药对羟基自由基的清除率公式可表达为：

清除率＝［1-（1-）／（1-4）］x100％

其中：去一加入中草药后催化动力学体系中溶液的荧光强度：一加入中草药前催化动力学体系中溶液的荧光强度：4一事保化动力学体系中只有苯甲酸存在洛液荧光强度。

1.42 样品对羟基自由基的清除率的测定

样品液的制备：准确称取粒度为450μm的样品1.0000g，在常温下，用60mL无水乙醇超声波提取3次，每次所用试剂20mL，时间间隔为10min，将3次提取液合并过滤，滤液用无水乙醇定容至100mL容量瓶中。

试剂制备：称取磷酸氢二钠7.16g，加入200mL水得0.1molL 溶液：称取磷酸二氢钾2.72g，加如200mL水 得0.1mol／L溶液。将两溶液混合，用pH酸度计调制成pH＝6.5的混合磷酸盐称取0.4000g苯甲酸（AR沈阳试剂厂），用pH＝9.5的混合磷酸盐溶液溶解后，用水稀释定容至100mL，避光保存备用：称取0.1547gCu，用1mol／L的盐酸溶解，制得100mL的1mol／LCu溶液配制30％的双氧水溶液。

取样品液0.2mL于25mL的比色管中，依次加入苯甲酸 过氧化氢Cu，用pH＝6.5的混合磷酸盐溶液稀释定容至25mL，摇匀，按清除率公式测得样品对羟基自由基的清除率。

1.4.3 计算结果

表3 计算结果

结论：肉苁蓉中黄酮类化合物的抗氧化性很强。

2 结果与讨论

（1）利用“超声波法”和“索氏提取法”分别对肉苁蓉中的总黄酮进行提取，这两种方法比较得出：超声波法大大缩短了提取时间，提高了有效成分的提出率，原料的利用率从而节省原料。相反索氏提取法既费时又费力，提取效果又不好，因此采用超声波法提取总黄酮是最佳的提取工艺，具有很强的现实意义。

（2）对总黄酮类化合物进行紫外光谱定性分析，得出芦丁是很合适的标准品，通过实验计算得肉苁蓉中总黄酮的含量很高，精密度较高，回收率在96.85％～99.46％，样品在2h之内基本保持稳定。

（3）应用荧光法对肉苁蓉中的总黄酮进行抗氧化性的分析测定，结论：计算清除率为91.5％，说明肉苁蓉自身具有很强的抗氧化作用，可清除自由基，抑制脂质氧化等，这在医学领域中对抗衰老、癌变、炎症、辐射组织缺血等疾病的研究具有很高的价值。