骨质疏松（Osteoporosis，OP）是一种好发于中老年人的系统性、慢性疾病，以骨密度下降和骨的显微结构破坏为主要特征。因患者的骨质脆性增加，其发生骨折的风险大大增加，轻微的外伤即可导致骨折。骨质疏松及其严重的并发症，给患者及其家庭和社会带来了沉重的经济负担，同时也严重地影响着患者的生活质量。据统计，我国老年人口总数已占总人口数的13.26％＂。因此，探究疗效更好、更安全的治疗骨质疏松的方法显得非常必要。目前对于骨质疏松的治疗主要采取药物治疗，包括以化学药为主的骨吸收抑制药、骨形成制剂、钙剂和维生素D等。另外，中医药治疗骨质疏松的报道也较多、其中尤以肉苁蓉为主要组方药材。

肉苁蓉味甘、咸、性温，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，常常用于治疗由肾阳亏虚、精血不足所引起的病证“。近来，也有动物实验表明其对阿尔茨海默病模型大鼠有保护作用＂。现代药理研究结果表明，肉苁蓉可以提高骨质疏松模型大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素及钙离子水平，促进大鼠成骨细胞骨形成蛋白2（BMP2）的表达，加快骨髓间充质干细胞的增殖，促使大鼠成骨细胞合成ALP等，从而达到治疗骨质疏松的作用。但目前对于肉苁蓉治疗骨质疏松的作用机制研究尚停留在单项的细胞试验与动物实验上，难以详细地探究其更全面的作用机制。

网络药理学以生物信息学、系统生物学、多向药理学、计算机科学等多个学科的技术和知识为基础，可多层次、全面地闸明药物治疗疾病的作用机制，使研究更能体现整体性和系统性。由于网络药理学强调从多靶标、多途径进行分析，这与中药及其复方中多成分、多靶标治疗疾病的特点不谋而合。因此，本研究采用网络药理学的方法，研究分析肉苁蓉的化学成分、作用靶标以及信号通路，并进行基因本体（Gene ontology.GO）分类富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto en-cyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析， 通过构建肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”网络，从整体性角度揭示肉苁蓉多靶标、多通路的作用网络，为进一步探究其治疗骨质疏松的作用机制提供参考依据。

1 资料

本研究使用的数据库及相关分析平台见表1。

2 方法

21 化学成分的获取与活性成分的筛选

于TCMSP中以“肉苁蓉”作为关键词，搜索获取肉苁蓉所含的所有化学成分信息。以口服利用度（OB）大于30％、类药性（DL）大于0.18作为限定条件＂”，筛选同时符合上述2个条件的成分作为活性成分。利用Pub-chem检索上述活性成分，得到各成分的3D结构并以mol2格式保存。

22 活性成分作用靶标及骨质疏松作用靶标的获取

本研究利用基于蛋白-配体相互作用亲合性函数的DRAR-CPI，使用该服务器通过分子对接预测各成分可

表1 本研究使用的数据库及相关分析平台

Tab 1 Involved database and related analysis plat-form in the study

能对应的靶标，并依据对接的紧密性进行打分。具体操作如下：将“2.1”项检索所得肉苁蓉所有活性成分的mol2格式文件上传至DRAR-CPI，选取Z-score＜-0.5 的靶点作为肉苁蓉活性成分的潜在靶点。利用UniProt知识库的UniProt Knowledgebase搜索功能，导入肉苁蓉作用的蛋白靶点的靶蛋白编号（PBD ID），限定物种为“人”，经过检索和转化操作，得到肉苁蓉活性成分的相应靶标。

利用GeneCards数据库和OMIM数据库，以“Osteo-porosis＂或“OP”作为关键词检索，在数据库中收集与骨质疏松相关的靶标。将所得靶标与肉苁蓉活性成分的靶标进行对比，以此筛选出共同的靶标。

2.3 “成分-靶标”网络构建与分析

将“2.1”项得到的肉苁蓉的活性成分和“2.2”项收集的治疗骨质疏松的靶标导人Cytoscape软件中，构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络。

2.4 靶标相互作用网络的构建与分析

利用String 数据库进行蛋白质之间及与预测蛋白质之间相互作用的搜索。将肉苁蓉的蛋白靶标导人Strin数据库，限定物种为“人”，获取肉苁蓉治疗骨质疏松的潜在靶标间的相互关系。利用Cytoscape软件，绘制蛋白相互作用网路，用Cytoscape的工具NetworkAna-lyzer进行网络分析，将节点大小和颜色设置为用于反映 Degree（连接度，即在网络中通过该点的边的个数）值的大小，边的粗细设置为用于反映结合分数的大小，最终获得靶标间的相互作用网络。

2.5 分子对接

利用Systems Dock WebSite进行网络药理学的预测和分析，研究配体对复杂的分子网络的作用。该服务器主要通过Dock-In评分（平台内置评分功能）的分子对接功能评估蛋白-配体结合活性，故可利用其得到相互作用网络中的Degree值，对Degree值排名前5的分子与肉苁蓉的活性成分进行分子对接验证。之后保存分子对接结果，并对其进行Docking Score评分，用以评价肉苁蓉活性成分与靶标之间的结合活性。

2.6 生物过程与通路分析

利用DAVID为大规模的基因或蛋白提供系统而综合的生物功能释信息的功能，获取最显著富集的生物学注释。即在DAVID中，对肉苁蓉的作用靶标进行GO通路和KEGG通路富集分析，保存结果。其中，GO通路富集分析可分为细胞组分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）和生物过程（Bi-ological process，BP）3部分。设定阈值P＜0.05，并按照涉及的靶标数目多少进行排序，筛选前20名的生物过程或通路，利用GraphPad Prism 绘制GO通路分析与KEGG通路分析图。

2.7“成分-靶标-通路”网络构建

分析“2.6”项中排名前20的作用靶标的KEGG通路，结合文献检索，筛选出可能与治疗骨质疏松密切相关的通路，获取富集在这些通路上的肉苁蓉治疗骨质疏松的潜在靶标，并与相应的活性成分相对应，构建肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”多维网络关系图。

3 结果

3.1 肉苁蓉活性成分分析

在TSCMP数据库中，以OB值大于30％、DL值大于0.18为筛选条件，收集肉苁蓉的活性成分，其中符合条件的活性成分共有13个，包括益母草碱、右旋喇叭茶醇、去咖啡酰基类叶升麻苷、京尼平酸等。另外，本研究还选择了部分OB值低于30％，但含较高，具有较高药理研究价值的活性成分，如橙花醛、蝙蝠葛碱、毛蕊花糖苷等。肉苁蓉主要活性成分基本信息见表2。

表2 肉苁蓉主要活性成分基本信息

Tab 2 General information of active ingredients of C. deserticola

3.2 潜在靶标预测

在服务器DRAR-CPI中检索肉苁蓉13个活性分子对应的潜在靶标，共得到258个，去除重复靶标后，共得137个潜在靶标。通过与GeneCards、OMIM数据库中与骨质疏松相关靶标的对比，筛选出抗骨质疏松的可能潜在靶标43个，其主要是成骨分化特异性转录分子2（RUNX2）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素6（IL-6）、骨生长蛋白因子（BGP）等。

3.3“成分-靶标”网络构建

通过将肉苁蓉活性成分和潜在靶标的相关信息输人软件Cytoscape中，构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络，见1

注：图中内圈六边形节点中的英文或缩写为活性成分名称，如Ty-rosol为酪醇，其余略：图中外圈圆形节点中英文缩写为靶标名称，如NOS1为一氧化氟合成酶，其余略

Note:English or abbreviations in the hexagonal node of inner cirde represent the name of active ingredient,such as Tyrosol;the rest is ab-breviated.English or abbreviations in cirde node of cuter cirde represent the name of target,such as NOSI means nitric axide synthase:the rest is abbreviated

图1 肉苁蓉“成分-靶标”网络

Fig 1 "Components-targets"network of C.deserticola

在图1中，共含有节点56个，边线185条。六边形节点即代表肉苁蓉活性成分，圆形节点代表潜在的靶标。边线代表活性成分与潜在靶标的相互关联。由此图可知，同一活性成分可以作用于不同靶标，同一靶标也可对应不同活性成分，体现出肉苁蓉治疗骨质疏松具有多成分、多靶标的特点。

3.4 靶标间相互作用网络的构建

通过数据库String获取肉苁蓉活性分子与骨质疏松相关靶标的相互关系，并将数据导人软件Cytoscape中构建靶标间相互作用网络，见图2。

由图2可知，靶标间相互作用网络中包含节点59个，边线453条。其中圆形节点代表靶标，边线代表靶标之间的相关性，节点的面积大小表示靶标的Degree值大小，节点面积越大，颜色越深，表示其Degree值越大。通过比较Degree值的大小，并结合现有的研究结果，推测肉苁蓉抗骨质疏松与RUNX2、VEGF、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、BGP这5个靶标有关。

3.5 分子对接

注：图中圆形节点上的英文缩写为靶标名称，如IL-6为白细胞介素6．其余略：节点面积大小表示靶标Degree值的大小

Note:English abbreviations in circle nodes represent the name of target,such as IL-6 means interleukin-6;the rest is abbreviated.The size of node area represents the size of target Degree value

图2 肉苁蓉潜在靶标间相互作用网络

Fig2 Potential target interaction network of C.deser-ticola

选取靶标相互作用网络中Degree值最大的5个靶标即RUNX2．VEGF、IL-6、TNF、BGP，将其名称输入软件System Dock WebSite，并与肉苁蓉的13个活性分子进行分子对接，5个靶标Docking Score值-活性成分数量结果见图3。

图3 5个靶标Docking Score值-活性成分数量柱状图

Fig 3 Histogram of five targets Docking Score-active ingredient quantity

由图3可知，在肉苁蓉13个活性分子与5个靶标的对接中，共有6个（占9％）的Docking Score值大于7.36个（占55％）的Docking Score值在5.0～7.0之间，18个（占28％）的Docking Score值在4.25～5.0之间，5个（占8％）的Docking Score值小于4.25。一般认为，DockingScore值大于4.25表示分子与靶标具有一定的结合能力．大于