[提 要] 目的：建立1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的原代培养新生鼠中脑多巴胺能神经细胞凋亡模型,并探讨肉苁蓉对中脑多巴胺能神经细胞的保护作用和机制。方法：采用血清药理学的方法,肉苁蓉含药血清孵育多巴胺能神经细胞,经MPP+处理后,用TUNEL 染色、流式细胞仪检测。结果：浓度为200μmol/L的MPP+使多巴胺能神经细胞发生典型的凋亡,流式细胞仪结果显示等效剂量肉苁蓉含药血清(动物灌胃浓度1.6g 原药材/kg)培养液组多巴胺神经细胞凋亡率为6.3%,空白模型组的凋亡率为30.2%,光镜下计数每视野凋亡阳性细胞数显示：含等效剂量肉苁蓉含药血清及2 倍等效剂量肉苁蓉含药血清培养液组明显低于模型组(P<0.05)。结论：肉苁蓉含药血清对神经毒素MPP+诱发的多巴胺能神经细胞凋亡具有一定的保护作用。

[关键词] 肉苁蓉 多巴胺能神经元 MPP+ 凋亡

目前,帕金森病(Parkinson's diseases, PD)的主要疗法为复方左旋多巴(L-dopa)制剂替代治疗,该治疗不能控制病情发展。随着病情的进展,服用剂量增大,一般在3～5 年内出现疗效减退、运动症状波动和药物性运动障碍。新近的研究发现L-dopa 对体外培养的神经元有诱导凋亡的作用[ 1、2],随后有人提出内源性多巴胺的神经毒作用导致的细胞凋亡是帕金森病多巴胺能神经元丧失的原因之一[3 ]。在长期的临床实践中,我们采用培补肝肾中药结合左旋多巴制剂治疗PD 取得了较好的疗效[4～6]。本实验从分子细胞水平探讨中药对多巴胺能神经元细胞凋亡的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM 培养基、1- 甲基-4- 苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridini um,MPP+)、胎牛血清购于Gibco公司。阿糖胞苷(cytarabine) 、多聚赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)购于Sigma 公司。24 孔培养板,25cm2塑料培养瓶购于NUNC 公司。所用中药购于西安饮片厂。所用动物由本校动物中心提供。

1.2 含药血清的制备与实验分组

肉苁蓉制备为冻干粉保存,用时以蒸馏水稀释。动物血清采用新西兰大耳白兔血清制备,均为健康雄性,体重为2.5～3.0kg。按体表面积折算动物的等效剂量,针对不同的处理随机分为：空白对照组血清；1/2 等效剂量组血清(灌胃剂量为肉苁蓉原药材0.8g/kg)；等效剂量组血清(灌胃剂量为肉苁蓉原药材1.6g/kg)；2 倍等效剂量组血清(灌胃剂量为肉苁蓉原药材3.2g/kg)。每天灌胃2 次,共给药3d,于末次灌胃1h后颈动脉放血,4℃过夜,2 500r/min 离心25min,小心分离血清,于56℃、30min 灭活,经0.22μm 滤膜抽滤除菌,-20℃保存。同等条件下,以等体积的生理盐水灌胃,制备空白兔对照血清。实验分为5 组,A 组为空白兔血清培养对照组；B 组为含2 倍等效剂量血清培养+MPP 处理组；C 组为含等效剂量血清培养+MPP 处理组；D 组为含1/2 等效剂量血清培养+MPP 处理组；E 组为空白兔血清培养+MPP 处理组。

1.3 中脑多巴胺能神经元的培养

选用怀孕14d 的SD大鼠3只,心脏内直接注射气栓处死；无菌条件下取出胚胎鼠,置于盛有冰D-Hanks 液的平皿中。体视显微镜下解剖分离出胎鼠脑组织,参考文献[7]方法稍作改进,剥除脑膜及血管组织,分离出中脑腹侧部A8、A9、A10 区的组织,眼科剪剪碎后加0.125%胰酶1mL 置于37℃孵箱约20min 后,加含有10%胎牛血清的培养液适量终止消化,用吸管吹打成均匀的细胞悬液,室温下以1 500r/min 离心5min,小心移去上清,以细口吸管吹打15 次,静置5min 后吸取上清计数,种植于预先包被有多聚赖氨酸的24 孔培养板内,每孔补加培养液将细胞密度调整为2×105个/mL,每孔加培养液至0.5mL,培养3d 后加用阿糖胞苷(终浓度为10μmol/L),抑制非神经元的生长。

1.4 酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色

采用SABC 法,抗体稀释液含牛血清白蛋白1g/100mL(博士德公司,武汉),0.3%Tritou-100(Sigma,美国),NaN3 80mg/100mL,用PBS 稀释成100mL,调pH 值为7.6。第7 天终止培养,D-PBS冲洗5min 3 次,新鲜配置的4% 的多聚甲醛室温固定30min,D-PBS 冲洗5min 3 次；用1∶1∶8 的过氧化氢、甲醇和PBS 液室温作用30min,D-PBS 冲洗5min 3 次；加入5%的封闭用羊血清室温作用30min,D-PBS 冲洗5min 3 次,加以抗体稀释液稀释的羊抗鼠TH 抗体(1∶1 000 稀释,Calbiochem公司),4℃过夜,D-PBS 冲洗3min 3 次,加入抗体稀释液稀释的生物素化小鼠抗大鼠IgG(1∶200 稀释,Sigma 美国),室温作用4h,D-PBS 冲洗3min 3 次,加入以抗体稀释液稀释的HRP复合物室温作用2h,D-PBS 冲洗3min 3 次。DAB 稀释液冲洗3min,加即用型 DAB 显色剂(武汉博士德公司)于细胞中,在倒置显微镜下观察显色。

1.5 药物处理

每天在相差显微镜下进行培养神经元的形态学观察并照相记录变化。培养12h 以后在倒置显微镜下观察细胞即将汇合前加药,各组培养液中血清含量均为10%,培养3d 后,加入MPP+,终浓度为200μmol/L。置37℃、5% CO2培养箱培养24h后做各种检查。

1.6 流式细胞仪检测

药物处理同前,各组经处理后,以0.125%胰蛋白酶,消化贴壁的PC12 细胞取细胞约1×106,PBS 将细胞洗2 次,加入490μL结合缓冲液,充分混匀细胞,加入5μL annexin V FITC和10μL 溶解的PI 于细胞悬浮液中,轻轻混匀,将试管置于

4℃,避光孵育10min, 上COULTER EPICS 流式细胞仪(美国Beckman Coulter 公司)检测。

1.7 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡

培养神经元的DNA 原位末端标记采用博士德公司的细胞凋亡检测试剂盒(MK1022),其步骤如下：取MPP+处理后各组多巴胺能神经元细胞(原代培养前玻片预先用多聚赖氨酸进行处理),经40g/L 多聚甲醛固定1h,新鲜的3%乙酸(pH2.5)室温作用10min,中和碱性磷酸酶,标本片加0.1mol/L TBS(pH7.5) 1∶200 新鲜稀释蛋白酶K37℃消化20s,每张玻片加TdT 和DIG-d-UTP 各1μL 及缓冲液18μL 的混匀液37℃标记2h；每个玻片加封闭液50μL,室温30min；加封闭液稀释的生物素化抗地高辛抗体50μL；37℃湿盒中反应30min；每张玻片加0.1mol/L TBS 稀释的SABC-AP50μL；BCIP/NBT(pH9.5的0.1mol/L TBS 按1∶20 稀释)加至标本上显色30min；同时设替代对照(用TdT缓冲液替代TdT/生物素-dUTP混合液),作显微照相和在倒置相差显微镜(200×)下观察凋亡细胞。在相差显微镜下进行阳性细胞计数,每组每孔计5 个视野,共计6 孔。

2 实验结果

2.1 培养神经元的形态学观察

采用OlympusIX70 相差显微镜观察：接种5h 后,绝大部分细胞贴壁,细胞分散,胞体圆形,核不可见,折光性强。培养至24h 时,细胞突起生长,并逐渐伸长。48h 多数细胞伸出带有分枝的细丝状突起,细胞形态多样,呈双极型、三极型、多极性,并逐渐形成稀疏的网络,胞体增大,呈圆形和椭圆形。经MPP+损伤后,细胞先肿胀,折光度增强,呈退变状态,最终细胞圆缩脱落。不同剂量的复方中药含药血清对MPP+损伤均有保护作用。培养物进行TH 免疫细胞染色后,可见TH 阳性细胞呈棕褐色,带有神经突起。加用等效剂量的中药血清作用后,TH阳性神经元的比例可达55%～60%。

2.2 流式细胞仪检测结果分析(见图1)

在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧。磷脂酰结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它与PS 具有高度的亲合力。因此,Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞膜表面的PS。同时结合PI 拒染法进行凋亡细胞双染,用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。在Fig.1 右下象限(FITC+/PI-)显示各组的凋亡细胞比例,各组细胞凋亡率分别为4.1%、5.8%、6.3%、28.6%、30.2%。

2.3 TUNEL 染色结果分析

细胞核中有蓝紫色颗粒者为阳性细胞,即凋亡的细胞。光镜下计数各组的凋亡细胞比例,各组每视野的凋亡细胞数分别为：A 组2.13±0.34；B 组4.92±0.67；C 组6.20±1.47；D 组10.33±1.51；E 组12.74±2.51。经t 检验分析,B、C两组与E 组相比(P <0.05)。其结果与流式细胞仪检测结果基本吻合。

3 讨论

帕金森病在中医属“颤证”范畴。中医认为PD 的发病多为老年人肝肾渐亏,脑髓经脉失养而出现的系列表现。治则上以滋补肝肾、平肝熄风为主。中药在治疗帕金森中可以起到“减毒增效”的目的,但其作用机理目前并不很明确。现代医学大量实验证据表明氧化应激反应是引起PD 神经细胞死亡的因子之一[3 ],研究发现肉苁蓉总苷能有效地清除各种活性氧自由基,保护OH·引发的DNA 氧化[8] 。肉苁蓉提取物tubuloside B 可以减弱MPP+诱导的细胞毒性,削弱细胞内活性氧的积聚,对MPP+诱导的凋亡和氧化应激有对抗作用[9]。中药可以启动和加强自身保护信号通路,抵抗外来损害,使其重新恢复平衡状态,这是中药现代化研究的目标之一。继多巴胺替代疗法之后,目前人们普遍看重神经保护性治疗,称之为帕金森病治疗的第二次革命。本实验采用中药含药血清培养离体的中脑多巴胺能神经细胞,发现肉苁蓉有一定的神经保护作用。本实验用流式细胞仪和TUNEL 染色两种检测手段同时发现,等效剂量组血清、2 倍等效剂量组血清的肉苁蓉含药血清培养能够降低MPP+所致的原代培养的中脑多巴胺神经细胞凋亡的细胞数目,对凋亡的细胞有一定的保护作用。中药能够早期保护多巴胺能神经元免受破坏,这是较其它疗法更具重要意义的举措。从这个意义上讲,中医中药的整体治疗就是治本之法,可以被视为目前人们所看重的神经保护性治疗方法之一。

参 考 文 献

1 Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopainduces apoptosis in cultured neuronal cells-apossible accelerator of nigrostriatal degenerationin Parkinson's disease? Mov Disord, 1997, 12(1)：17

2 Jenner PG,Brin MF. Levodopa neurotoxicity:experimentalstudies versus clinical relevance.Neurology,1998,50(6Suppl 6)：S39

3 Maruyama W, Naoi M. Cell death in Parkinson's disease.J Neurol, 2002, 249(Suppl 2)：II6

4 陈建宗,江 文,史 健,等.培补肝肾为主治疗帕金森病临床观察：附60 例病例报告.成都中医药大学学报,1999,22(3)：14

5 陈建宗,陈小莉,李军昌,等.培补肝肾法治疗帕金森病40例临床观察.中医药研究,1998,14(3)：10

6 陈建宗,江 文,吴宝仁,等.平颤1 号口服液治疗帕金森病40 例.安徽中医学院学报,1999,18(2)：9

7 Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. A high percentageyield of tyrosine hydroxylase-positive cells from ratE14 mesencephalic cell culture. Brain Res,1992,586(2):319

8 王晓雯,蒋晓燕,邬利娅·伊明,等.肉苁蓉总苷体外清除自由基及对OH·引发的DNA 损伤的保护作用.中国药学杂志,2001,36(1)：29

9 Sheng G, Pu X, Lei L,et al. Tubuloside B fromCistanche salsa R escues the PC12 neuronal cells from1-Methyl-4-phenylpyridinium ion-induced apoptosisand oxidative.Stress.Planta Med,2002,68(11)：966