摘 要 目的：研究肉苁蓉提取物对败血症休克大鼠急性肝肺胸腺功能损伤的影响，探讨败血症休克治疗方法。方法：采用盲肠结扎穿孔术（ CLP） 复制败血症休克模型，观察肝肺胸腺组织病理学变化，测定急性肝肺胸腺损伤生物学指标和肉苁蓉提取物的影响。结果：大鼠在CLP 术后，生理盐水组肝细胞线粒体Ⅲ态，P／O 比值和呼吸控制率明显降低，线粒体膜钠钾钙镁-ATP 酶活性显著降低；肺湿干重比，肺泡通透指数，肺毛细血管通透性，肺组织丙二醛均显著升高，超氧化物歧化酶显著降低；胸腺细胞凋亡和DNA 断裂百分率显著增加。肉苁蓉给药组，上述指标均较生理盐水组显著改善，达到或接近假手术组水平。结论：肉苁蓉对败血症休克大鼠急性肝肺胸腺损伤具有良好保护作用，其机制可能是减少氧自由基对组织的损伤，改善细胞膜功能，提高机体免疫功能和应激能力。

主题词 植物提取物／药理学 肉苁蓉／药理学 败血症／并发症 休克，脓毒性／中医药疗法 大鼠

本研究观察了肉苁蓉对败血症休克模型大鼠急性肺肝胸腺等脏器损伤的影响，试图从保护细胞功能为突破口，探讨肉苁蓉在败血症中的作用效果和作用机制，为开发对败血症有效保护性治疗药物作出有益的探索。

1 材料和方法

1．1 药物、试剂与仪器 药物：戊巴比妥钠（ 中国医药集团上海化学试剂公司） ，丙二醛（ MDA） 试剂盒，超氧化物歧化酶（ SOD） 试剂盒，ATP 酶试剂（ 南京建成生物工程研究所） ，肉苁蓉（ 经三峡大学中医系汪金均植博士鉴定） 水煎剂，伊文思蓝。仪器：日立H-600型透射电镜，流式细胞仪（ EPICS，BeckmanCoulter 公司） ，721型分光光度计。

1．2 肉苁蓉提取物的制备 采用浸提法制备肉苁蓉提取物，取干重肉苁蓉200g，置于烧杯中，按1∶10的比例加入蒸馏水，常规浸泡30min 至1h，在电炉上加热1h 后，过滤，如此反复进行2次，收集所得滤液加热蒸发浓缩至1g／mL，冷却后密闭保存于4℃冰箱中备用。

1．3 动物及败血症动物模型 健康雄性SD 大鼠（ 华中科技大学实验动物中心提供，体重200～250g。动物随机分为3组，假手术组（ n＝8） ，生理盐水对照组（ n＝8） ，肉苁蓉组（ n＝8） 。假手术组和对照组给予生理盐水（1．0mL／kg） 灌胃，给药组予1g／mL （ 给药剂量200mg／kg） 的肉苁蓉灌胃，1d2次，喂至15d。生理盐水对照组和肉苁蓉组采用盲肠结扎穿孔术［1］复制败血症模型，手术前动物自由饮水，禁食12h。

1．4 大鼠肝线粒体ATP 酶活性和肝线粒体呼吸功能测定 术后16h 取大鼠肝脏6g 迅速置于0℃分离介质（ 蔗糖250mmol，乙羟乙基哌嗪2－乙基磺酸2mmol，乙二胺四乙酸0．1mmol，pH7．4） ，采用差速低温离心分离的方法制备大鼠线粒体。采用定磷法［2］测ATP 酶活性。采用Clark 氧电极法［3］，用JYD－IA 溶氧测定仪记录线粒体氧化还原反应曲线，计算Ⅲ态、Ⅳ态呼吸率，呼吸控制率（ RCR） 和磷氧比值（ ADP／O） 。

1．5 大鼠肺组织学和肺功能测定 术后16h 开胸取出肺脏左叶，称湿重后，置烤箱（80℃，20h） 烤至衡重，称干重，计算湿／干重比。肺泡灌洗液以考马氏亮蓝法测定蛋白含量，计算肺通透指数（ 肺泡灌洗液蛋白／血浆蛋白，LPI） 。按照Zhou 等［4］介绍的静脉注射伊文思（ Evans） 蓝法，测定大鼠肺血管通透性（ PVP） 变化。采用硫代巴比妥酸（ TBA） 法［5］测定大鼠肺组织丙二醛（ MDA） 活性。采用黄嘌呤氧化酶法［6］测定SOD 活性。

1．6 胸腺组织学检查和细胞凋亡率测定 每组中取2～3只大鼠在术后相应的时间处死，分离完整胸腺，制作常规石蜡切片，HE 染色，光镜观察；2．5％戊二醛固定，制作电镜切片，透射电子显微镜观察。另制作胸腺细胞悬液，流式细胞仪检测位于凋亡区内的细胞数量，得到凋亡细胞的百分率。按Burton等［7，8］ 的方法（ 二苯胺法） ，酶标仪检测计算胸腺细胞基因组DNA 断裂百分率。

1．7 统计处理 实验数据均以均数±标准差（ x±s） 表示，SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析，P ＜0．05为有统计学差异。

2 结 果

2．1 肝线粒体Ⅲ态，RCR 和P／O 比值的改变 对照组呼吸Ⅲ态速率，明显低于假手术组（ P ＜0．01） ，Ⅳ态呼吸速率较假手术组变化不明显，而致对照组RCR 显著低于假手术组（ P＜0．01） ，肉苁蓉治疗组RCR 较接近于假手术组。对照组ADP／O 比值降低，肉苁蓉治疗组其比值回升，与假手术组相比，具有显著性差异（ P ＜0．01） 。

0.5

2．2 肉苁蓉对线粒体ATP 酶活性的影响 见表2。对照组肝细胞线粒体膜钙－ATP 酶，钠-钾ATP 酶，镁-ATP 酶，钙镁-ATP 酶活性明显低于假手术组。肉苁蓉治疗组的各酶活性均显著高于相应对照组，达到假手术组水平。

2．3 肉苁蓉对大鼠肺组织湿／干重比（ w／d） 、PVP、LPI、MDA 和SOD 的影响 见表3。

2．4 肉苁蓉对胸腺细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果表明，与假手术组相比，对照组术后胸腺细胞凋亡显著增加，而肉苁蓉提取物可有效降低凋亡率，DNA 断裂百分率的发生情况与流式细胞仪检测的结果基本一致（ 表4） 。

2．5 肉苁蓉对胸腺组织学变化的影响 石蜡切片观察假手术组的胸腺无明显病理改变，胸腺细胞密集分布于胸腺皮质，细胞核呈圆形，深蓝色着染，胞质少；过渡到髓质后，逐渐以核较大而着色浅的上皮网状细胞为主。对照组动物胸腺皮质区细胞成分稀疏，淋巴细胞减少，巨噬细胞增多，局部可见灶状坏死及散在的细胞碎片。胸腺髓质巴细胞无明显减少，细胞分布较皮质区密集，形成所谓“皮髓倒置”现象。肉苁蓉给药组动物胸腺细胞碎片明显减少，“皮髓倒置”现象也有显著改善。电镜观察对照组可见大部分细胞体积缩小，细胞表面皱缩，起泡，染色质凝聚，有些细胞呈月牙状，细胞凋亡小体的形成，细胞坏死溶解情况常见。肉苁蓉治疗组细胞形态发生改变明显减少，细胞坏死溶解的现象得到显著改善。

3 讨 论 多器官功能障碍综合症是败血症休克后期病情不可逆转和死亡率高的根本原因，保护器官功能对降低败血症休克临床高死亡率具有重要意义。肉苁蓉是我国传统补益类中草药，始载于《神龙本草经》，是传统益精血、补肾壮阳的著名珍贵中药之一。近代药理学研究表明，它能提高机体免疫功能和应激能力，促进DNA 合成，抗γ射线，抗衰老，增强细胞DNA 合成率，保护组织细胞等。其中所含的主要包括肉苁蓉多糖（ CDPS） 、D-甘露醇，能有效地清除自由基。肉苁蓉多糖还能促进T 、B 淋巴细胞的增殖反应，且与ConA、PHA 有协同刺激小鼠胸腺细胞增殖的作用。本实验立足改善和保护败血症休克重要生命器官功能和中医扶正治疗思想这一基本点出发，采用客观灵敏的检测手段观察了肉苁蓉对败血症休克大鼠肝线粒体Ⅲ态，呼吸控制率（ RCR） ，P／O 比值，膜ATP 酶和肺通透指数，肺血管通透性，肺组织MDA，SOD 活性，胸腺细胞凋亡的影响。实验结果表明，肉苁蓉能提高肝线粒体RCR，P／O 比值，增强肝线粒体呼吸功能，加快线粒体呼吸链电子传递，提高氧化磷酸化的藕联程度和膜ATP 酶的活性，增加细胞内ATP 合成量。肉苁蓉给药组肺通透指数，肺血管通透性均显著下降，肺组

织丙二醛活性下降，超氧化物歧化酶显著上升。提示肉苁蓉通过其抗氧化作用减轻氧自由基对肺组织细胞的损害，对肺损伤具有良好的保护作用。败血症休克时胸腺细胞，尤其是未成熟的T-淋巴细胞大量凋亡，可能会引起释放进入外周淋巴器官中的成熟淋巴细胞减少，继而直接或间接损害机体免疫功能。纠正败血症休克中胸腺细胞凋亡异常情况对提高机体免疫力是有益的。本实验研究发现肉苁蓉提取物可明显改善胸腺细胞凋亡，对败血症动物胸腺细胞有明显的保护作用。进而增强机体在感染过程中的免疫力，减少外来毒素对重要脏器的损害。而且我们也发现给药组血压得到明显改善，死亡率显著降低，与肉苁蓉增强肝肺细胞功能，降低胸腺细胞凋亡呈显著正相关，

说明肉苁蓉改善机体重要生命器官功能，增强机体免疫力可能是肉苁蓉治疗感染性休克的重要药理学基础。肉苁蓉对急性脏器损伤具有较显著的保护作用，其机制可能为：①抗膜酯质过氧化作用，增强膜稳定性，减轻自由基对膜结构的损害。②促进组织核酸合成及减缓核酸分解及破坏作用，促进蛋白质合成，加速组织细胞的修复和再生。③增强机体免疫功能，减轻致病因素对机体的损害。④抑制组织细胞的过度凋亡。⑤改善机体微循环，保证重要生命器官的血供。

参考文献

［1］ 金惠铭，盲肠结扎穿孔术后的败血症模型［J］．中国病理生理杂志，1990，6（2） ：126．

［2］ 汪 谦，朱晓峰，赵西龙．现代医学实验方法［M ］．北京：人民卫生出版社，1997：342．

［5］ 汪 谦，朱晓峰，赵西龙．现代医学实验方法［M ］．北京：人民卫生出版社，1997：508-510．

［6］ 张秀明，李健斋，魏明竟，等．现代临床生化检验学［M］．北京：人民军医出版社，2001：896-899．

［8］ 何维敬，李 伟，毕 正，等．检测白血病细胞凋亡的二苯胺法［J］．上海医学检测杂志，2001，16（3） ：160．