提要:目的:研究败血症肝线粒体ATP 酶活性的变化及肉苁蓉对其影响。方法:40 只SD 大鼠随机分假手术组、12 小时对照组、12 小时给药组、16 小时对照组、16 小时给药组, 采用盲肠结扎穿孔术( C LP) 复制败血症模型, 比较各组存活率和平均动脉压( MAP) 、肝线粒体ATP 酶活性的变化。结果:大鼠在复制败血症模型后, 肝线粒体ATP 酶活性降低, 24 小时存活率明显下降。给予肉苁蓉后肝线粒体ATP 酶活性较对照组明显改善( P <0.05) , 与大鼠死亡率的降低呈显著正相关。结论:败血症线粒体ATP 酶活性下降, 细胞钙超载和水肿坏死是败血症大鼠死亡的直接原因, 肉苁蓉增强ATP 酶活性是肉苁蓉治疗败血症的重要机制。

关键词:肉苁蓉　败血症　线粒体　ATP 酶

败血症是临床急危重症, 尽管近30 年来, 抗生素不断更新, 但败血症的死亡率并无明显下降,仍高达50%[ 1] 。单纯西药抗菌“ 祛邪” 治疗并不能改善败血症的预后。败血症在中医病机上属“ 正虚邪实” , 治疗上必须“ 扶正” 和“ 祛邪” 并举的原则, 中药在败血症的治疗上显示出巨大的潜力。败血症并发多器官衰竭是其死亡率居高不下的根本原因, 细胞结构损伤是多器官衰竭的微观病理基础[ 2] 。肉苁蓉作为传统补益类中药, 现代药理学研究表明肉苁蓉具有抗膜酯质过氧化, 保护细胞功能的作用[ 3] 。线粒体能量代谢功能是细胞的基本功能之一, ATP 酶的活性是衡量线粒体能量代谢功能的重要指标。本实验观察了败血症大鼠肝细胞线粒体ATP 酶活性的变化及肉苁蓉对其影响与大鼠死亡率之间的关系, 旨在为临床上败血症的“ 扶正”治疗提供理论依据和有效探索。

1　材料和方法

1.1　试剂　肉苁蓉购自新疆( 经三峡大学医学院谭德福教授鉴定) , 取干重肉苁蓉200g, 蒸馏水煎2 次, 所得滤液蒸发浓缩至浓度1g/ ml 。戊巴比妥钠( 001104) , 中国医药集团上海化学试剂公司;ATP 酶试剂( 20030108) , 南京建成生物工程研究所。

1.2　实验动物模型与分组　雄性SD 大鼠40 只( 购自华中科技大学同济医学院实验动物中心) , 随机分为5 组:假手术组( n =8) , 12 小时对照组(n =8) , 12 小时给药组( n =8) , 16 小时对照组( n=8) , 16 小时给药组( n=8) 。假手术组和对照组给予生理盐水灌胃, 给药组予1g/ml 的肉苁蓉灌胃, 1 日2 次, 喂至15 天。采用盲肠结扎穿孔术[ 4] 复制败血症模型, 手术前动物自由饮水, 禁食12 小时。

1.3 　平均动脉压的测定　颈静脉插入头皮针, 肝素抗凝, 左侧颈总动脉插管至主动脉弓处, 用自制导管与生理多道仪相连, 记录平均动脉压( MAP) 。待MAP 平稳后进行实验。

1.4 　线粒体ATP 酶活性测定　取大鼠肝脏6g 迅速置于0℃分离介质〔蔗糖250mmol, 乙羟乙基哌嗪2 -乙基磺酸2mmol, 乙二胺四乙酸0.1mmol,pH7.4〕, 剖开洗去杂质, 以分离介质悬浮( 1∶10) , 用Teflon 电动匀浆器匀浆( 1200r/ min) , 以2000r/ min 离心10 分钟, 留置上清液, 以10000r/min 离心15 分钟, 弃去上清液, 取沉淀物以2ml分离介质进行悬浮得到线粒体悬液, 全部过程在0～ 4 ℃进行。采用定磷法[ 5] 测ATP 酶活性( 试剂盒购自南京建成生物工程研究所) 。

1.5　统计学处理　实验数据均以均数±标准差( X±S) 表示, SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析。

2　结　果

2.1 　肉苁蓉对平均动脉压和24 小时大鼠死亡率的影响　盲肠结扎穿孔术后12 小时对照组血压显著降低, 16 小时更趋明显, 与假手术组比较, 有显著差异。肉苁蓉治疗组血压得到改善。对照组死亡率与假手术组相比较, 死亡率显著上升, 给药组死亡率较相应对照组明显降低。见表1 。

3　讨　论

Na +-K+-ATP 酶又称钠钾泵, 在维持细胞生理活动, 体温及正常代谢, 调节细胞内外离子平衡中发挥重要生理作用。败血症线粒体内膜存在严重钠泵功能障碍, 致线粒体水肿。Na+ -K+ -ATP 酶受到损害, 线粒体内外离子浓度失衡加重,能量代谢酶活性受抑制, 细胞能量供应衰竭, 造成细胞毒性水肿, 同时膜通透性增加, 最终导致细胞死亡。实验中我们发现, 败血症肝细胞线粒体Na+-K +-ATP 酶活性明显降低( P <0.01) , 表明肝组织损害严重。而在给予肉苁蓉后, 肝线粒体Na+-K +-ATP 酶活性明显增高( P <0.05) , 败血症大鼠死亡率显著降低。实验结果提示, Na+-K+-ATP 酶的活性降低与败血症大鼠的病情发展成显著正相关, Na+-K +-ATP 酶活性抑制, 细胞水肿和死亡致多器官衰竭可能是败血症病情迅速发展的重要机理之一。近年有关Na +-K +-ATP 酶与许多疾病相关的报道较多, 引起临床和基础工作者的关注, 研究Na+-K +-ATP 酶的活性变化规律及其调节具有重要意义[ 6] 。关于Na + -K+ -

ATP 酶在败血症发展转归中具体作用机制知之甚少, 尚待进一步研究。细胞内钙和镁的稳定是维持细胞内释放反应和信息传递的必须物质基础[ 7] 。实验中对照组Ca2 +-ATP 酶活性下降直接影响钙泵活性, 钙泵活性下降, 使线粒体钙泵向细胞外排Ca2 +的作用减弱,线粒体内Ca2 +超载。线粒体内钙超载是线粒体氧化磷酸化障碍、结构受损和细胞坏死的重要原因[ 8 、9] 。Ca2 + 超载, 使线粒体膜电位降低, 组织ATP 含量下降[ 10] , 组织细胞能量利用障碍。Ca2 +可激活线粒体上的磷脂酶, 致线粒体膜损伤, 破坏线粒体正常合成ATP 的功能致线粒体能量产生障碍[ 11] 。线粒体钙代谢紊乱可直接影响线粒体呼吸功能, 致线粒体摄氧和电子传递链质子氧化障碍[ 12] 。同时Ca2 +升高, 可加重酯质过氧化对线粒体的损害[ 13] 。这些都直接或间接导致细胞能量供应衰竭和组织器官的死亡, 加速了败血症的病理变化发展。实验中我们还发现败血症大鼠Mg2 + -ATP 酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP 酶活力也明显下降。Mg2 +-ATP 酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP 酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质, Widner 报道细胞内镁离子的减少是细胞不可逆损伤的诱发因素, Mg 2 +/Ca2 +比值是反映细胞不可逆损伤的重要指标[ 14] 。肉苁蓉给药组Mg2 + -ATP 酶和Ca2 + -Mg2 + -ATP 酶活性增强, A TP 酶是一种巯基酶, 肉苁蓉具有抗膜酯质过氧化作用, 这可能是肉苁蓉增强ATP 酶活性的化学基础及药理学基础[ 15] 。败血症线粒体能量代谢障碍, ATP 酶活性下降, 线粒体水肿, 细胞内钙超载, 钙镁平衡紊乱是败血症细胞死亡及多器官衰竭形成的直接原因。肉苁蓉拮抗膜酯质过氧化, 增强A TP 酶活性, 保持细胞内钙镁稳态, 保护细胞功能正常运转是肉苁蓉降低败血症大鼠死亡率的重要机制, 展示了肉苁蓉在治疗败血症中的良好前景。

参　考　文　献

[ 1] 董伟贤, 胡必杰, 何礼贤.122 例医院败血症对照危险因素研究.中华医院管理杂志, 2001, 17 ( 2) ∶101 ～ 103

[ 2] 张钟灵.多器官衰竭与败血症.新医学, 1999, 30 ( 6)∶351 ～ 352

[ 3] 施大文, 何松春, 蒋莹.中药肉苁蓉及其同属生药对免疫功能及酯质过氧化作用的影响.上海医科大学学报, 1995, 22( 4) ∶306 ～ 308