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败血症休克是临床上常见的危重病例病死率居高不下。在其病理损伤中胸腺细胞凋亡的作用日益受到重视。胸腺中T－淋巴细胞的过早异常凋亡是引起机体免疫抑制的主要原因之一。研究表明肉苁蓉能有效的提高机体免疫功能和应激能力清除自由基反应对细胞具有保护作用［1］。本实验拟观察了肉苁蓉对CLP 诱导的败血症动物模型中胸腺细胞凋亡及细胞线粒体膜电位、ATP 酶的影响。
材 料 和 方 法
1 材料
1∙1 动物 健康雄性Wistar 大鼠由华中科技大学同济医学院动物中心提供体重180－200g。1∙2 试剂与仪器 Annexin－Ⅴ及PI 双标试剂盒购自Immunotech（France）公司ATP 酶活性测定试剂盒购自南京建成生物研究所Rhodamine123为Sigma 公司产品其他试剂均为国产分析纯。流式细胞仪型号：EPICS（Beckman Coulter 公司）。
2 药物的提取
生药肉苁蓉（Cistanches deserticola Y．C．Ma）水煎3次煎液合并浓缩至适当体积加入一定量的乙醇静置24h 后过滤滤液放至无乙醇味。用前加蒸馏水配成所需浓度。
3 模型与动物分组
动物按体重随机分3组（n＝28）：假手术组＋生理盐水CLP 术＋生理盐水CLP 术＋肉苁蓉提取物（CDYC）。均于术前14d 开始灌胃每天1∙25g／kg。CLP 诱导败血症动物模型的建立参照文献［2］ 进行。各组动物分别于术后12h 和24h 处死处死后行病理解剖学检查并留取内脏备用。
4 方法
4∙1 凋亡细胞百分率测定 在不同时点处死动物后迅速分离完整胸腺取其中一半制作胸腺细胞悬液光镜下调整细胞浓度至（2－5）×106cells／L。应用Annexin－Ⅴ及PI 双标试剂盒检测流式细胞仪分析检测10000个细胞计数位于凋亡区内的细胞数量得到凋亡细胞的百分率。
4∙2 DNA 断裂百分率 取300μL 胸腺细胞悬液与等量低张细胞膜裂解缓冲液混匀致细胞膜破裂13000r／min 离心10min将上清液倒入另一支试管将二苯胺法略加变动后测定［3］。计算DNA 断裂百分率的公式：［上清液DNA 含量／（上清液DNA 含量＋沉淀DNA 含量）］×100％。
4∙3 线粒体膜电位测定 取胸腺细胞2×106个加入Rhodamine123染液（终浓度10mg／L）避光于37℃染色30min立即用流式细胞仪分析。
4∙4 线粒体ATP 酶活性测定 将另一半胸腺组织加入匀浆介质用玻璃匀浆器手工匀浆制成10％的组织匀浆。差速离心得到乳白色胸腺细胞线粒体悬液。按说明书的要求测定Na＋ －K＋ －ATP 酶和Ca2＋－ATP 酶的活性及蛋白含量。
4∙5 大鼠在进行CLP 术后不同时点断颈处死取胸腺固定常规石蜡切片HE 染色光镜观察并拍照。
5 统计学处理
实验数据用﹣x±s 表示采用SPSS10∙0分析软件计量资料用方差分析。
结 果
1 染色片观察
CLP 后12h 和假手术各组的胸腺无明显病理改变胸腺细胞密集分布于胸腺皮质细胞核呈圆形深蓝色着染胞质少；过渡到髓质后逐渐以核较大而着色浅的上皮网状细胞为主。生理盐水组在CLP术后24h 动物胸腺皮质区细胞成分稀疏淋巴细胞减少巨噬细胞增多局部可见灶状坏死及散在的细胞碎片。胸腺髓质淋巴细胞无明显减少细胞分布较皮质区密集形成所谓“皮髓倒置”现象。CLP 术后24h＋肉苁蓉提取物组动物胸腺细胞碎片明显减少“皮髓倒置”现象也有显著改善。
2 肉苁蓉对败血症大鼠胸腺细胞凋亡率的影响
染色后将细胞分为3个亚群：Annexin－Ⅴ－／PI－亚群为活细胞；Annexin－Ⅴ＋／PI－亚群为凋亡细胞；Annexin－Ⅴ＋／PI＋亚群为坏死细胞（图1）。流式细胞仪检测结果表明与假手术组相比CLP 术后12h胸腺细胞凋亡即显著增加24h 更加明显而肉苁蓉提取物可有效降低凋亡率（表1）。
图1 流式细胞仪检测败血症大鼠胸腺细胞凋亡率3 肉苁蓉对败血症大鼠胸腺细胞DNA 断裂百分率的影响
DNA 断裂百分率的发生情况与流式细胞仪检测的结果基本一致（表1）。
4 肉苁蓉对败血症大鼠胸腺细胞线粒体膜电位的改变
细胞经Rhodamine123染色流式细胞仪检测固定一标尺可分为两群细胞：荧光强度低（△Ψmlow）的和荧光强度高（△Ψmhigh）的细胞。图1表明CLP 术后12h 荧光强度低的细胞显著增多由假手术（2∙02±0∙77）％增加到（16∙66±1∙48）％给药组的线粒体膜电位为（10∙32±1∙54）％；24h 组由（5∙60±0∙63）％增加到（32∙46±1∙40）％给药组为（20∙40±0∙44）％。
5 肉苁蓉对败血症大鼠胸腺细胞线粒体ATP 酶活性的改变
败血症大鼠胸腺细胞线粒体Na＋－K＋－ATP 酶和Ca2＋－ATP 酶的活性与sham 组相比均有显著下降（P＜0∙01）。
讨 论
线粒体是细胞内能量合成的主要场所对维持细胞正常的生理功能起着重要作用。细胞缺血缺氧加以内毒素的直接攻击首先受损的是线粒体。近年来细胞凋亡机制研究的一重大突破就是对线粒体重要性的认识大量实验证实许多因素诱导的细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱［4］。线粒体的功能障碍在整个细胞损伤过程中起重要作用寻求保护细胞器（包括溶酶体、线粒体等）的药物可望对“难治性休克”的防治开辟一条新途径。实验表明［5］内毒素中毒性休克能引起线粒体Ca2＋、Mg2＋含量改变功能受损。正常情况下Na＋－K＋－ATP 酶具有精确平衡细胞内外Na＋、K＋浓度的作用；Ca2＋－ATP 酶则是一种维持细胞内外Ca2＋浓度平衡的Ca2＋泵它同Na＋／Ca2＋交换共同维持细胞内Ca2＋稳态。败血症休克时细胞内线粒体受累而引起Na＋－K＋－ATP 酶活性下降可导致细胞内Na＋滞留使细胞水肿。而Ca2＋－ATP 酶活性下降可严重影响膜内外Ca2＋的转运导致细胞内Ca2＋超载损害线粒体结构、功能促进自由基生成。本研究提示败血症休克后胸腺细胞ATP 酶活性显著下降（P＜0∙01）。预先使用肉苁蓉防治后明显提高各组Na＋－K＋－ATP 酶和Ca2＋－ATP 酶活性且同时间点的流式细胞仪检测胸腺细胞凋亡率、DNA 断裂百分率有明显降低提示保护细胞线粒体可能是肉苁蓉保护败血症休克胸腺细胞的机制之一。
罗丹明123是一种亲脂性阳离子荧光染料其荧光信号主要集中于线粒体荧光强度的变化反映了线粒体膜电位的变化。在大多数情况下线粒体膜电位的降低［6］表明线粒体膜通透性转运孔（mitochondrial
permeability transition poreMPTP）的开放。MPTP 的开放导致线粒体释放caspase 活化物活化caspase引起细胞凋亡。本实验研究发现肉苁蓉提取物显著地抑制CLP 术后12h 和24h 胸腺细胞线粒体膜电位的下降因而保持线粒体膜电位可能是肉苁蓉降低胸腺细胞凋亡率的机制之一。
［参 考 文 献］
［1］ 顾海欧阴 健．药理作用［A］．见：阴 健郭力弓主编．中药现代研究及临床应用［M］．第1版．北京：学菀出版社1993．298－230．
［2］ Wichteman KABaue AEChaudry IH．Sepsis and septicshock：A review of laboratory models and a proposal ［J］．JSurg Res198029（2）：189－201．
［3］ 何维敬李 伟毕 正等．检测白血病细胞凋亡的二苯胺法［J］．上海医学检验杂志200116（3）：160．
［4］ Searlett JLSheard PWHughes Get al．Changes in mitochondrialmembrane potential during staurosporine inducedapoptosis in Jurkat cells［J］．FEBS Lett2000475（3）：267－272．
［5］ 黄启福朱陵群许文忠等．大鼠内毒素休克肝线粒体含量变化与线粒体损伤［J］．中国病理生理杂志199410（5）：507－510．
［6］ Green DRReed JC．Mitochondria and apoptosis ［J］．Science1998281（28）：1309－1312
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