摘　要　目的:研究肉苁蓉对感染性休克大鼠肝线粒体功能的影响。方法:采用盲肠结扎穿孔术( CLP) 复制感染性休克模型, 采用多导生理仪监测平均动脉压( MAP) 的变化, 定磷法测定肝线粒体ATP酶活性, 采用Clark氧电极法测定呼吸控制率( RCR) 、Ⅲ 态的变化。结果:大鼠在CLP术后, 线粒体ATP酶活性、RCR和Ⅲ 态显著降低。肉苁蓉给药组肝线粒体ATP酶活性、RCR和Ⅲ 态较对照组明显改善, 与大鼠死亡率的降低呈显著正相关。结论:肉苁蓉能增强实验性感染性休克大鼠线粒体能量代谢功能。

关键词　肉苁蓉;感染性休克;线粒体;ATP酶;RCR

肉苁蓉( CistanchedeserticolaY.C.Ma)具有延缓衰老、抗膜脂质过氧化、增加细胞DNA合成率, 抗疲劳等作用[ 1] 。研究发现发现肉苁蓉能减轻感染性休克肝损伤, 降低感染性休克大鼠死亡率[ 2] 。感染性休克早期肝线粒体能量代谢功能降低是感染性休克肝损伤的始动环节[ 3] 。以改善肝线粒体能量代谢为突破口, 有可能开拓感染性休克治疗的新领域。本文观察了肉苁蓉对感染性休克大鼠肝脏线粒体ATP酶活性和呼吸控制率( RCR) 、Ⅲ 态的影响, 以探讨肉苁蓉抗感染性休克作用机制。

1　材料与方法

1.1 　试验药物　肉苁蓉购自新疆, 取干肉苁蓉200g, 蒸馏水煎2次, 收集所得滤液蒸发浓缩至浓度1g/ml。

1.2 　动物　雄性SD大鼠40只, 体重200g～ 250g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.3　试剂与仪器　ATP酶试剂( 20060108)南京建成生物工程研究所。JYD-IA溶氧测定仪, 江苏电分析仪器厂。

1.4　方法　大鼠随机分为5组, 假手术组, 12小时对照组, 12小时给药组, 116小时对照组, 16小时给药组。假手术组和对照组给予生理盐水灌胃, 给药组予1g/ml的肉苁蓉( 200mg/kg)灌胃1日2次, 喂至15天。采用盲肠结扎穿孔术[ 4] 复制感染性休克模型, 手术前动物自由饮水, 禁食12小时。

1.4.1　平均动脉压的测定　颈静脉插入头皮针, 肝素抗凝,左侧颈总动脉插管至主动脉弓处, 用自制导管与生理多导仪相连, 记录平均动脉压( MAP), 待MAP平稳后进行实验。

1.4.2　线粒体ATP酶活性测定　取大鼠肝脏6g迅速置于0℃分离介质( 蔗糖250mmol, 乙羟乙基哌嗪2 -乙基磺酸2mmol, 乙二胺四乙酸0.1mmol, pH7.4), 剖开洗去杂质, 以分离介质悬浮( 1∶ 10), 用Teflon电动匀浆器匀浆( 1200rpm), 以2000rpm离心10分钟, 留置上清液, 以10000rpm离心15 分钟,弃去上清液, 取沉淀物以2ml分离介质进行悬浮得到线粒体悬液, 全部过程在0 ～ 4℃进行。采用定磷法[ 5] 测ATP酶活性。

1.4.3　线粒体呼吸功能的测定　采用Clark氧电极法[ 6] , 取反应介质( 0.225mol/L 蔗糖, 15mmol/L KCl, 15mmol/LKH2PO4, 50mmol/LtrisHCl, 1mmol/LEDTA, pH7.5) 2.9ml, 加入搅拌反应杯中, 恒温30℃.加入线粒体悬液0.1ml, 以琥珀酸(终浓度10mmol/L)为底物, 反应1 分钟后, 加入600nmol/LADP,用JYD-IA溶氧测定仪记录线粒体氧化还原反应曲线, 计算Ⅲ态、Ⅳ态、RCR。

2　结果

2.1　肉苁蓉对感染性休克大鼠平均动脉压和24小时大鼠死亡率的影响　盲肠结扎穿孔术后对照组12 小时血压显著降低, 16小时更趋明显。肉苁蓉治疗组血压改善, 死亡率明显降低, 见表1。

2.2　肉苁蓉对感染性休克大鼠线粒体呼吸功能的影响　对照组呼吸Ⅲ 态速率明显低于假手术组, Ⅳ态呼吸速率较假手术组变化不大, 而致对照组RCR显著低于假手术组, 给药组RCR较接近于假手术组。对照组ADP/O比值随时间延长逐渐降低, 肉苁蓉治疗组其比值逐渐回升, 与大鼠死亡率相关性分析( r=0.892) , 见表1。

2.3　肉苁蓉对感染性休克大鼠线粒体ATP酶活性的影响　给药组钠钾ATP酶、钙ATP酶、镁ATP酶、钙镁ATP酶活性均显著高于相应对照组达到假手术组水平, 与大鼠死亡率降低呈显著的正相关( r=0.834) , 见表2。

3　讨论

　　感染性休克后期多器官衰竭的形成是感染性休克死亡率居高不下的根本原因。肝脏是机体能量代谢中心, 又是多器官衰竭最易受累的器官之一。研究表明, 感染性休克细胞水平能量代谢障碍早于其他病理生理改变, 是多器官功能障碍综合征的诱因。线粒体是机体合成ATP的主要细胞结构, 改善线粒体能量代谢是降低感染性休克死亡率的重要手段。本文观察了肉苁蓉对感染性休克大鼠肝脏线粒体Ⅲ 态和RCR的影响, 对照组12小时Ⅲ 态和RCR较假手术组显著降低, 16小时组更趋严重。Ⅲ 态下降提示感染性休克肝线粒体膜电子传递链损伤, ATP合成酶活性下降。RCR下降表明线粒体氧化磷酸化耦联程度降低, 线粒体合成ATP障碍。肉苁蓉给药组RCR和Ⅲ 态显著上升, 表明肉苁蓉能加快肝线粒体电子传递链速度, 提高氧化磷酸化耦联程度。张勇通过实验证实连续服用14天肉苁蓉水煎液的小鼠, 体重明显增加, 常压耐氧量能力亦显著优于对照组, 负重游泳时间显著延长[ 7] 。韩丽春等用肉苁蓉的水煎液对小鼠灌胃, 小鼠负荷运动后骨骼肌超微结构显示肌糖元含量丰富, 运动后线粒体普遍增生、肥大[ 8] 。可见肉苁蓉不仅能增强机体能量代谢功能, 提高细胞能量储备, 而且还能从结构上使线粒体适应机体病理及生理改变。

　　Na+-K+-ATP酶镶嵌于线粒体内膜, 在维持细胞生理活动、体温及正常代谢, 调节细胞内外离子平衡中发挥重要生理作用。Na+-K+-ATP酶活性下降, 线粒体钠泵功能障碍, 致线粒体内膜水肿, 线粒体膜流动性下降。Hackenbrock和Slater的实验研究表明呼吸链上电子传递过程和氧化磷酸化耦联过程均依赖于呼吸链活性成分在内膜中的侧向扩散和碰撞, 即膜流动性。膜流动性增大, 则电子传递加快[ 9, 10] 。Na+-K+-ATP酶是维持线粒体膜流动性正常的关键酶, 膜流动性的降低导致线粒体氧化磷酸化功能障碍, ATP合成不足, 又直接降低Na+-K+-ATP酶的活力, 二者互为因果, 构成恶性循环。Ca2 +-ATP酶、Mg2 +-ATP酶和Ca2 +-Mg2+-ATP酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质, Ca2 +-ATP酶活性下降使线粒体钙泵向细胞外排Ca2 +的作用减弱, 线粒体内Ca2 +超载。线粒体内钙超载是线粒体氧化磷酸化障碍, 结构受损和细胞坏死的重要原因[ 11, 12] 。Widner报道细胞内镁离子的减少是细胞不可逆损伤的诱发因素,Mg2 + /Ca2 +比值是反映细胞不可逆损伤的重要指标[ 13] 。肉苁蓉给药组Na+-K+-ATP酶、Ca2 +-ATP酶、Mg2 +-ATP酶、Ca2 +-Mg2 +-ATP酶活性均较对照组显著上升, 提示肉苁蓉通过加快线粒体电子呼吸链传递速度和提高氧化磷酸化效率明显增加线粒体ATP合成量, 保证了膜上ATP酶所需能量供应。同时ATP酶是一种巯基酶, 肉苁蓉具有抗膜脂质过氧化作用, 这可能是肉苁蓉保护ATP酶的化学基础及药理学基础。

参考文献

1　李琳琳, 王晓雯, 王雪飞, 等.肉苁蓉总甙的抗脂质过氧化作用及抗辐射作用.中国中药杂志, 2006;22( 6) ∶364 ～ 367

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4　金惠铭, 盲肠结扎穿孔术后的败血症模型.中国病理生理杂志,1990;6 ( 2) ∶ 126 ～ 127

5　汪谦.现代医学实验方法.北京:人民卫生出版社, 1997∶342

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7　张勇, 吴焕, 王顺年, 等.三种肉苁蓉壮阳补肾作用的比较.中国中药杂志, 2004;11 ( 3) ∶22

8　韩丽春, 候金凤, 纪志华, 等.肉苁蓉对小鼠血清肌酸激酶和骨骼肌超微结构的影响.中国中药杂志, 2005;18( 12 )∶ 743

9　HackenbrockCK, BaueAE, JohnsonD, etal.Lateraldiffusionandelectrontransferinthemitochondriainnermembrane.TrendsBiochem Sci, 2005;6( 12 ) ∶151 ～ 158

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11　MergnerWJ, HangRR, JacksonJB, etal.Studiesonthepathogenesisofischemiccellinjury..Ⅵ .Accumulationofcacium byisolatedmitochondria.VirchowsArcBCellPathol.2007;26∶1

12　LenenS, GorlichJK, RustenbeckI, etal.RegulationoftransmembraneintransportbyreactionproductsofphospholipaseasinfectsoflypiphospholipilidonmitochondrialCa2+ transport.Biochem BiophysActa, 2006;982 ∶140146

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