公司网址：www.www.wagawa.com
厂家服务热线：0903-6682528
全国服务热线：400-966-8288
公司地址：新疆和田洛浦县杭桂路232号
感染性休克是临床急危重症死亡率高寻找和开发有效治疗药物一直是困扰科研和临床工作者的重大问题。近年国内学者对中药在感染性休克中的作用进行了广泛的研究发现丹参参附大黄肉苁蓉和许多中药复方制剂对感染性休克中多器官衰竭具有确切疗效能显著降低实验动物并发症和死亡率但其具体作用机制尚不清楚。研究资料表明感染性休克早期线粒体的摄氧功能和氧化磷酸化功能明显降低直接促成了感染性休克后期的发展变化线粒体的损伤在感染性休克中的作用不容忽视。改善感染性休克各器官线粒体功能可能是中药治疗机理之一。本实验中我们观察了肉苁蓉对感染性休克大鼠肝脏线粒体ATP 酶活性和呼吸控制率（RCR）ADP／O 比值的影响以及与大鼠死亡率之间的关系为阐明肉苁蓉治疗感染性休克的机制进行积极探索。
1 材料与方法
1∙1 材料
1） 试药与仪器 肉苁蓉1200g蒸馏水煎2次所得滤液蒸发浓缩至浓度1000g／L。戊巴比妥钠（001104）中国医药集团上海化学试剂公司；ATP 酶试剂（20030108） 南京建成生物工程研究所。JYD-IA 溶氧测定仪江苏电分析仪器厂。
2） 实验动物 雄性SD 大鼠40只体重（210±20） g购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。1∙2 方法
1） 动物分组与给药 动物随机分为5组每组8只假手术组12h 对照组12h 给药组16h对照组和16h 给药组。假手术组和对照组给予生理盐水灌胃给药组予1000g／L 肉苁蓉灌胃2次／d连续15d。采用盲肠结扎穿孔术［1］ 复制感染性休克模型手术前动物自由饮水禁食12h。
2） 平均动脉压的测定 颈静脉插入头皮针肝素抗凝左侧颈总动脉插管至主动脉弓处用自制导管与生理多道仪相连记录平均动脉压（MAP）待MAP 平稳后进行实验。
3） 线粒体ATP 酶活性测定 取大鼠肝脏6g 迅速置于0℃分离介质〔蔗糖250mmol／L乙羟乙基哌嗪2-乙基磺酸2mmol／L乙二胺四乙酸0∙1mmol／LpH 7∙4〕剖开洗去杂质以分离介质悬浮（1∶10）用Teflon 电动匀浆器匀浆（1200r／min）以2000r／min 离心10min留置上清液以10000r／min离心15min弃去上清液取沉淀物以2mL 分离介质进行悬浮得到线粒体悬液全部过程在0℃～4℃进行。采用定磷法［2］ 测ATP 酶活性。
4） 线粒体呼吸功能的测定 采用Clark 氧电极法［3］ 取反应介质（0∙225mol／L 蔗糖15mmol／LKCl15mmol／L KH2PO450mmol／L trisHCl1mmoL／L EDTApH7∙5） 2∙9mL加入搅拌反应杯中恒温30℃。加入线粒体悬液0∙1mL以琥珀酸（终浓度10mmol／L） 为底物反应1min 后加入600nmol／L ADP用JYD-IA 溶氧测定仪记录线粒体氧化还原反应曲线计算Ⅲ态Ⅳ态RCR和ADP／O 比值。1∙3 统计学处理实验数据以均数±标准差表示SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析。P ＜0∙05为差异有显著性。
2∙1 大鼠平均动脉压和24h 死亡率变化盲肠结扎穿孔术后对照组大鼠12h 血压显著降低16h 更趋明显与假手术组比较差异有显著性见表1。肉苁蓉治疗组血压得到改善。对照组死亡率与假手术组相比较死亡率显著上升给药组死亡率较相应对照组明显降低。
2∙2 线粒体呼吸功能的变化
对照组呼吸Ⅲ态速率明显低于假手术组（P ＜0∙01）Ⅳ态呼吸速率较假手术组变化不大而对照组RCR 显著低于假手术组（P ＜0∙01）给药组RCR较接近于假手术组。对照组ADP／O 比值随时间延长逐渐降低见表2。肉苁蓉治疗组其比值逐渐回升与假手术组相比差异具有显著性与大鼠死亡率呈显著的正相关（r ＝0∙892）。
2∙3 线粒体ATP 酶活性变化
给药组钠钾ATP 酶钙ATP 酶镁ATP 酶钙镁ATP 酶活性均显著高于相应对照组达到假手术组水平见表3。与大鼠死亡率降低呈显著的正相关（ r ＝0∙834）。
3 讨 论
摄氧功能和氧化磷酸化功能是线粒体能量代谢的重要组成部分。感染性休克造成组织急性缺氧使线粒体内膜呼吸功能复合体得不到及时氧供应NADH 不能经呼吸链氧化成NAD＋质子不能从呼吸链上脱落呼吸链传递功能受阻氧化磷酸化严重障碍。感染性休克中急性缺血缺氧线粒体内膜损伤通透性增加肿胀内膜蛋白、脂类组分丢失有序结构改变流动性降低是直接导致线粒体摄氧功能障碍和电子传递活性下降的原因。本实验中对照组12h Ⅲ态和RCR 较假手术组显著降低（P ＜0∙05）16h组更趋严重（P ＜0∙01）。Ⅲ态下降提示感染性休克肝线粒体膜电子传递链损伤ATP 合成酶活性下降。RCR 是线粒体在有ADP 时的快速摄氧速率与ADP 耗尽后的摄氧速率之比值它是评价线粒体完整性和氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标之一。本实验观察到肉苁蓉给药组RCR 和Ⅲ态显著上升表明电子传递链速度加快氧化磷酸化藕联程度提高。Na＋-K＋-ATP 酶镶嵌于线粒体内膜是保证线粒体结构和功能的重要离子泵。实验中对照组该酶活性下降提示感染性休克线粒体内膜存在严重钠泵功能障碍致线粒体内膜水肿线粒体膜流动性下降。Hackenbrock 和Slater 研究表明呼吸链上电子传递过程和氧化磷酸化藕联过程均依赖于呼吸链活性成分在内膜中的侧向扩散和碰撞即膜流动性。膜流动性增大则电子传递加快［45］ 。蒋建新等［6］ 研究发现感染性休克肝线粒体微粘度各向异性和荧光偏振度都非常显著地升高。这些都提示膜流动性显著降低可能是线粒体氧化磷酸化功能障碍的重要原因之一。Na＋-K＋-ATP 酶是维持线粒体膜流动性正常的关键酶肉苁蓉能显著提高Na＋-K＋-ATP 酶活力可能是肉苁蓉改善线粒体能量代谢的重要机理。保持细胞内钙和镁的稳定是维持细胞内释放反应和信息传递的必须物质基础［7］ 。实验中对照组钙ATP 酶活性下降直接影响钙泵活性钙泵活性下降使线粒体钙泵向细胞外排Ca2＋ 的作用减弱线粒体内Ca2＋超载。线粒体内钙超载是线粒体氧化磷酸化障碍结构受损和细胞坏死的重要原因［89］ 。对照组RCR 较假手术组急剧下降可能与线粒体内钙超载有关。同时我们也发现肉苁蓉治疗组镁ATP 酶和钙镁ATP 酶活力较对照组高。镁ATP 酶和钙镁ATP 酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质Widner报道细胞内镁离子的减少是细胞不可逆损伤的诱发因素Mg2＋／Ca2＋比值是反映细胞不可逆损伤的重要指标［10］ 。肉苁蓉维持细胞内钙酶稳态是肉苁蓉恢复细胞正常能量代谢的重要前提。总之肉苁蓉能从细胞水平降低线粒体内膜通透性维持内膜正常有序结构和线粒体膜流动性改善线粒体呼吸功能加快电子呼吸链的传递提高氧化磷酸化效率稳定细胞内钙镁稳态减少自由基形成增强线粒体能量代谢功能这是肉苁蓉能从整体升高感染性休克平均动脉压和降低模型给药组的死亡率必然原因。本实验从能量代谢角度阐明了肉苁蓉治疗感染性休克的机制为更深层次的研究提供了有效的理论线索。
［参考文献］
［1］ 金惠铭∙ 盲肠结扎穿孔术后的败血症模型［J］ ∙中国病理生理杂志19906 （2）：126～127∙
［2］ 汪谦朱晓峰赵西龙∙现代医学实验方法［M］ ∙北京：人民卫生出版社1997：342∙
［3］ Estabrook R W∙Oxidative and phosphorylation methods in enzymology ［C］ ∙new york：Academic Press1967∙45～51∙
［4］ Hackenbrock C KBaue A EJohnson D et al∙Lateral diffusion and electron tranfer in the mitochondriainnerme mbrane ［J］ ∙TrendsBiochem Sci19986 （12）：151～158∙
［5］ Slater E CToda KKayano K et al∙A hypothesis for the michanism of respiratory chain phosphorylation not involving the electrochemicalgradient of protons as obligatory intermedicate ［J］ ∙ Biochem Biophys Acta1995811 （3）：217～230∙
［6］ Jiang J Xwang J WChen HS et al∙Studies on michanism of mouse liver mitochondria injury following septic shock ［J］ ∙TraumaJournal China199410 （2）：67～69∙
［7］ Mela LPharo R LSordah L A et al∙Spectrophotometric measurements of the kinetics of Ca2＋ and Mg2＋ accumulation mitochondria
［J］ ∙ Biochemistry19967 （11）：4059～4072∙
［8］ Mergner W JHang R RJackson J B et al∙Studies on the pathogenesis of ischemic cell injury∙Ⅵ∙Accumulation of cacium by isolatedmitochondria ［J］ ∙Virchows Arc B Cell Patho∙l 199726 （4）：1～8∙
［9］ Lenen SGorlich J KRustenbeck I et al∙Regulation of transmembrane in transport by reaction products of phospholipase as infects oflypiphospholipilid on mitochondrial Ca2＋ transport ［J］∙Biochem Biophys Acta1999982 （26）：140146～140152∙
［10］ Widener L LParks D AClarks A J et al∙Vevepamil pretreatment preserves mitochondrial function and tissue magnesium in the ischemickidney ［J］ ∙Circ Shock199413 （1）：27～36∙
公司：win德赢官方
地址：新疆和田洛浦县杭桂路232号
公司网址：www.www.wagawa.com
厂家服务热线：0903-6682528
全国服务热线：400-966-8288
