摘要: 目的探索肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤化疗耐药MG － 63 细胞的逆转作用及对多药耐药蛋白1( MＲP1) 和P53 蛋白表达的影响。方法通过肉苁蓉水溶液灌胃SD 大鼠获得高、中、低剂量组的含药血清及空白组血清。贴壁培养法培养MG － 63 细胞，MTT 法检测药物干预前MTX 的IC50值，将MG － 63 细胞分为高剂量组( A) 、中剂量组( B) 、低剂量组( C) 、空白组( N) ，采用IC50浓度的MTX 分别干预各组贴壁细胞，24 h 后A、B、C 组加入相应的肉苁蓉含药血清，空白组加入对照组血清，持续干预至盐水组细胞在IC50浓度的MTX 中稳定生长各组停止干预。MTT 法检测各组细胞对MTX 的耐药倍数，流式细胞仪检测MＲP1 的表达，Western blot 检测P53 蛋白的表达。结果干预后A、B、C、N 四组细胞耐药指数( ＲI) 依次为: 1． 80、2． 55、2． 84、3． 74; 肉苁蓉含药血清干预后各组细胞MＲP1 的表达均下调，与空白组相比较有明显统计学差异( P ＜ 0． 001) ; 相比较于空白组，药物干预后各组P53 蛋白表率达均下调，各组比较有统计学意义( P ＜ 0． 01) 。结论肉苁蓉能有效逆转化疗耐药骨肉瘤MG － 63 细胞的耐药性，其机制可能与下调MＲP1 及P53 蛋白的表达有关。

关键词: 骨肉瘤; 化疗耐药; 多药耐药相关蛋白1; P53 蛋白; MG － 63; 肉苁蓉

骨肉瘤( Osteosarcoma，OS) 是临床最多见的原发恶性骨肿瘤，起源于间叶组织，多见于青少年，好发于股骨远端和胫骨近端，病死率高［1］。Ｒosen 在1978 年首次提出了辅助化疗联合手术切除的理念，近年来由于新辅助化疗理念的不断完善已将OS患者5 年生存率从20% 提升至70%［2］。OS 治疗的成败需综合手术完整的切除与化疗敏感性综合评估，术前化疗可有利于瘤体完整的切除，肿瘤细胞对化疗药的耐药是导致术后局部复发与转

移的最常见原因，因此，化疗的高敏感性对OS 患者的预后及生存期有着重要的临床意义，而耐药是OS 患者化疗失败最常见且最难解决的问题之一。

近年来，中药因其低毒、多通路协同抗肿瘤的优势，研究者们对于中医药逆转肿瘤耐药性的研究做了大量开拓性的研究，且部分研究得到了佐证。大多扶正类药物如人参［3］、黄芪［4］等中药，不仅可以提高自身免疫功能，同时也可以逆转肿瘤细胞的多药耐药，肉苁蓉可改善肿瘤化疗后造血和免疫功能低下，有增效减毒之效［5］。OS 化疗抵抗的患者往往表现为免疫功能及造血功能的低下，因此，本研究在体外试验的水平上，通过观察肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤MG － 63 /MTX 耐药细胞P 糖蛋白( P － glycoprotein，P － gp) 及多药耐药相关蛋白1( MDＲ － associated protein 1，MＲP1) 的影响，初步探索肉苁蓉逆转骨肉瘤化疗耐药的分子机制。

1 材料与仪器

1． 1 细胞株MG － 63 细胞，购自上海中科院细胞研究所。

1． 2 动物SPF 级SD 大鼠［10 周龄，体重( 270 ± 30) g］88 只，购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号:62001000000427。

1． 3 试剂胎牛血清、0． 25% Trypsin － EDTA、高糖DMEM 培养基( Cellmax 公司，批号分别为: 20161213、20171102、20170919) ;甲氨蝶呤( 大连美仑生物技术有限公司，批号: 15475 － 56 － 6) ;肉苁蓉( 甘肃天力士中天药业有限责任公司，批号: 1802025) ，由甘肃数字草本检验中心有限公司鉴定; MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒( 大连美仑生物技术有限公司，货号: MA0198) ; 兔单克隆抗体P53 抗体( abcam 公司，批号: ab32389) ; 山羊抗兔( bioeasy 公司，批号: BE0101) ; 鼠抗人单克隆抗体MＲP1 抗体( Biolegend 公司，批号: 370104) 。

1． 4 仪器MCO － 5AC 型细胞培育箱( 日本三洋电机公司) ; ＲT－ 6100 型酶标仪( 深圳雷杜生命科学股份有限公司) ; SW － CJ －1 FD 型超净台( 苏州净化股份有限公司) ; LMQ 型高压蒸汽灭菌机( 山东新华医疗器械有限公司) ; TDZ4 － WS 型低速离心机( 长沙平凡仪器有限公司) ; XK96 － 3 型微量振荡器( 姜堰市医疗器械有限公司) ; PowerPoc 型凝胶电泳仪( 美国Bio － rad 公司) ;ChemiDocTM 型凝胶成像分析仪( 美国Bio － rad 公司) 。

2 实验方法

2． 1 制备含药血清将肉苁蓉制备为全药粉末，沸水稀释。随机将大鼠分为四组，高剂量组( 7． 2g·kg － 1 ) 、中剂量组( 0． 72g·kg － 1 ) 、低剂量组( 0． 36g·kg － 1 ) 及盐水灌胃组，每日2 次，连续灌胃7d。第7 天给药后60 min 内所有大鼠均在10% 水合氯醛( 3ml /kg) 麻醉下心脏采血。静置1． 5h 后，4℃ 4000r /min 离心10min，收集上层血清， 15ml 离心管分装，再次离心取上层血清后0． 22μm 滤膜过滤除菌，－ 80℃冰箱保存待用。

2． 2 药物干预前MTT 法测定MTX 对MG － 63 细胞的IC50 MG－ 63 细胞在25cm2 的透气培养瓶贴壁培养，隔48h 用含10%FBS 的H － DMEM 培养基换液，5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。取处对数生长期的MG － 63 细胞，胰酶消化，调整密度至4 × 104 /ml 的单细胞悬液，按照MTX 的梯度浓度( 20，5，0． 5，0． 05，0． 005，0) μg·ml － 1 接种6 组细胞到96 孔板，每个浓度设5 复孔，每孔180μl，4h 后依次加入各浓度的MTX，48 小时后各孔加入20μl MTT( 5mg·L － 1 ) ，4h 后弃孔内废液，各孔加入200μl DMSO，摇床上震荡，10min 后96 孔板于全自动酶标仪上检测各孔560nm 的吸光度，重复3 次。计算各浓度下MTX 对MG － 63 细胞的抑制率，以药物浓度和抑制率做回归分析后得到IC50值。

2． 3 分组干预及细胞耐药诱导将MG － 63 细胞分为肉苁蓉高剂量( A) 组、肉苁蓉中剂量( B) 组、肉苁蓉低剂量( C) 组及对照( N) 组。取对数生长期的人骨肉瘤MG － 63 细胞，胰酶消化后制备成悬液，调整密度为5 × 105 个，接种4 小时后4 组均加入含IC50浓度的MTX 的完全培养液，各组分别加入相应浓度的肉苁蓉含药血清， 24h 后换液，各组细胞活性恢复后，重复上述步骤，培养至N 组细胞可以在含MTX 的培养液中稳定生长以后，各组

均干预。

2． 4 MTT 法检测药物干预后MG － 63 细胞对MTX 的耐药指数同“2． 2”的方法测定药物干预后MTX 对MG － 63 细胞的IC50，计算耐药倍数。

2． 5 流式细胞仪检测肉苁蓉对化疗MG － 63 耐药细胞MＲP1 的表达干预完成后，4 组各取一瓶，胰酶消化后制备成单细胞悬液，4℃、1200 r /min 离心5min，弃上清，加入5ml PBS，4℃、1200 r /min离心5min，去上清，取106 个细胞于1． 5 ml EP 管，加1ml PBS，4℃、1200 r /min 离心5min，去上清，加50μl PBS，混匀后加5μl MＲP1 抗体， 15min 后加入500μl PBS，混匀后上机检测，重复3 次，取均值。

2． 6 蛋白印迹法检测肉苁蓉对化疗MG － 63 耐药细胞P53 蛋白的表达各组取1 瓶对数期细胞，细胞裂解后提取总蛋白，BCA 法定量样品蛋白，95℃ 水浴锅煮沸10 min，制备10% 的分离胶及5%的浓缩胶，蛋白上样30μg，80V 恒压电泳至染料到达分离胶底部停止电泳，恒流120mA 转膜1 h，5% 脱脂奶粉封闭60 min，加入P53 一抗( 1∶ 1000 比例稀释) ，4℃、摇床上孵育过夜，次日PBST 洗涤3 次，每次10 min，加入山羊抗兔辣根酶标记的二抗( 1∶ 5000) ，室温孵育1 h，PBST 洗涤3 次，每次10 min，调整凝胶成像分析仪的相关参数，ECL 发光液显影并采集图像信号， Image J软件分析各组条带灰度值，通过样品蛋白与内参蛋白的灰度值比值，间接分析P53 的相对表达量。

2． 7 统计学分析所有数据均采用SPSS 22． 0、GraphPad Prism 7统计软件处理，计量资料以珋x ± s 表示，组间样本比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，以P ＜ 0． 05 判断为差异有统计学意义。

3 结果

3． 1 各组细胞MTX 药敏测定与正常MG － 63 细胞相比，各组药物干预后的耐药细胞对MTX 的IC50均升高( 表1) ; 与N 组相比，药物干预后的三组细胞对MTX 的IC50降低，A 组明显低于空白组。各组耐药指数( ＲI) 分别为: 1． 80、2． 55、2． 84、3． 74。

3． 2 各组细胞MＲP1 蛋白的表达结果与空白组相比，肉苁蓉含药血清干预后各组MG － 63 细胞中MＲP1 蛋白表达率明显降低，有显著统计学差异( P ＜ 0． 001) ; 同时，MＲP1 蛋白的表达与肉苁蓉含药血清浓度呈负相关，A 组MＲP1 的表达最低，与B 组、C 组比较有统计学差异( P ＜ 0． 01) 。见图1，表2。

3． 3 各组细胞P53 蛋白的表达结果与空白组相比，肉苁蓉含药血清干预组细胞中P53 蛋白率明显呈低表达，有统计学差异( P＜ 0． 01) ，高、中剂量组细胞中P53 表达明显降低，与空白组比较有显著差异( P ＜ 0． 001) ( 图2，表3) ，且P53 蛋白的表达率与药物的浓度呈反比关系。

4 讨论

化疗耐药性的产生会使得肿瘤细胞免受化疗药物攻击，是影响OS 患者化疗效果的关键因素。研究发现肿瘤化疗的敏感性与药物的活化摄运障碍、肿瘤细胞DNA 修复能力提高、细胞周期阻滞与凋亡失衡、自噬等有关［6，7］，其中关系最密切的是抗癌药物的活化摄运障碍，肿瘤细胞可借某些膜蛋白的跨膜转运功能将化疗药物排出细胞外，从而达到降低细胞内有效药物浓度的目的，进而降低化疗药物的杀伤作用。ABC 跨膜转运家族成员P －

gp 及MＲP1 的表达异常与化疗药物的外排作用密切相关，主要通过将化疗药物由胞内转至胞外，降低了OS 细胞内有效作用浓度，从而产生耐药性［8，9］。P53 基因与细胞周期及凋亡、细胞DNA 损伤的修复等生

物学功能有关，分为野生型和突变型［10］。野生型P53 可将细胞周期阻滞到G0期，最终导致细胞的程序性死亡［11］，但因其不稳定的性质，极易突变，其半衰期仅20 ～ 30 min，故不易被检测。突变后的P53 基因的稳定性增加，同时半衰期延长到了2 ～ 12 小时，容易被检测［12］。突变后的P53 基因不但会导致肿瘤细胞的过度增殖，诱发肿瘤新生，而且会抑制正常的细胞色素C 的释放［13，14］。在OS 中，秦晓飞［15］发现OS 组织

P53 蛋白阳性表达率升高，与患者化疗敏感性降低及预后不良有关。Zhang ZF 等［16］认为OS 细胞的迁移与恶性增殖度与P53 密切相关，沉默P53 基因可降低OS 细胞的增殖与迁移率。MＲP1 基因与P － gp 的功能相似，可借助耦合物谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶耦将化疗药物泵出胞外［8］。已有的研究发现MＲP1 蛋白的表达率与多种肿瘤细胞的耐药性相关，且与患者的预后相关。MＲP1 的表达与骨肉瘤的恶性程度及耐药性产生过程有着密切的关联，如屠重棋等［17］通过对比正常骨组织和OS 组织中MＲP1 的表达，发现MＲP1 在OS 中存在表达，且与恶性程度呈正相关。Tao Y 等［18］发现与人骨肉瘤MG63 和HOS 耐药细胞中CD133、MＲP1、MDＲ1 均呈高表达。张洪泉等［19］发现肉苁蓉多糖可以增强小鼠Lewis 肺癌和小鼠S180 肉瘤的抑制率。刘智勤［5］发现肉苁蓉对抗环磷酰胺化疗S180 小鼠有增效减毒之效。最新研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞提高黑色素瘤荷瘤小鼠生存期，提高了肿瘤小鼠的存活率［20］。现代研究表明，肉苁蓉具有提高免疫力、抗氧化、抗衰老、保肝、保护心肌、抗肿瘤等作用［21］，本次研究发现肉苁蓉在体外水平具有有逆转人骨肉瘤化疗MG － 6 细胞对MTX 的耐药作用，机制可能与肉苁蓉下调MＲP1 及P53 蛋白的表达水平有关，且下调水平与药物浓度呈正相关。但参与OS 产生化疗抵抗的机制较多，如DNA 损伤修复学说、酶系统介导的耐药、自噬等，因此肉苁蓉逆转化疗MG － 63 细胞的耐药性是否与其他机制参与有待进一步研究。

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