[ 摘要] 　目的:研究中药肉苁蓉对神经母细胞瘤细胞烟碱型乙酰胆碱受体表达的影响及其对抗β 淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性作用机制, 以探讨其在阿尔茨海默病(alzheimer' s disease , AD)治疗中的作用。方法:比色法测定细胞MT T 还原率筛选肉苁蓉安全浓度范围, 并用Aβ25-35处理细胞后, 测定M TT 还原率, 蛋白质印迹法(We ster n blo tting)测定烟碱型乙酰胆碱受体α3 、α7 蛋白表达的变化;TBA 比色法测定脂质过氧化产物(丙二醛)的水平。结果:肉苁蓉能提高细胞α3 及α7 烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白质表达水平;并能对抗Aβ25-35 引起的α3 和α7 受体亚单位蛋白质水平降低;同时能减弱Aβ25-35 引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高。这些作用随浓度的增加而增强。结论:肉苁蓉能上调烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白表达水平,且能对抗Aβ 25-35 的神经毒性作用, 在AD 的治疗中可能起到一定作用。

[ 关键词] 　肉苁蓉;神经母细胞瘤细胞;尼古丁受体;β-淀粉样蛋白;阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(alzheimer' s disease , 简称AD)是一种主要在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性变疾病, 其主要临床表现为进行性认知功能障碍、记忆力衰退、性格和行为改变等[ 1-3] 。病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年斑形成为主要特征[ 4] 。老年斑的主要成分为β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide ,Aβ), 是一种神经毒性物质,可以引起神经元的损伤和死亡, 是AD 发病过程中的一个重要因素, 能促进AD 的发生和发展。烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic ace ty lcholinereceptor , nAChR 或称尼古丁受体)与学习和记忆等认知功能密切相关, 并具有明显的神经保护作用[ 5] 。在较早的一些研究中就发现, AD 患者大脑皮层尼古丁受体出现持续和严重的丢失, 大脑皮层nAChR 缺失与AD 患者认知障碍有显著的相关性。由于AD 的发病机制复杂, 目前尚无有确切疗效的治疗药物。中医药在延缓衰老以及防治痴呆等相关疾病方面有着丰富的理论和实践经验, 具有潜在的优势和广阔的发展前景。肉苁蓉作为一种著名的补益药, 在延缓衰老, 增强机体免疫功能、激活超氧化物歧化酶活性和降低体内脂褐素堆积方面都有着重要的作用[ 2] 。本研究用Aβ25-35 处理来源于人脑的神经母细胞瘤(SH-S Y5Y)细胞作为研究对象,以研究肉苁蓉神经保护作用机制。

1　材料

肉苁蓉来源于新疆的德赢vwin登录 [ Cistanch tubulosa(Schenk .)R .Wight] , 由贵阳医学院药学院提供并鉴定。D-MEM 培养液(英国Gibco Invitrogen 公司);源于人脑的SH-SY5Y 细胞(德国German Collectionof Microorganisms and Cell Cultures 公司);羊抗α3 、α7 及鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体及HRP 标记的抗羊及抗鼠二抗(美国Santa Cruz BiotechnologyInc);聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus 发光试剂、高效显影胶片(Amersham 公司);其他化学试剂均购自Sigma 公司。

2　方法

2.1　肉苁蓉液的制备　肉苁蓉生药加10 倍量的水煮2 次, 每次1 h , 滤过, 合并滤液, 滤液用旋转蒸发仪70 ℃减压回收溶液, 测定体积, 计算浓度。最后质量浓度为1 g 生药·mL-1 。

2.2　细胞培养,β-淀粉样肽及肉苁蓉的处理　先用含15 %胎牛血清的DMEM 培养液培养SH-SY5Y细胞, 待细胞生长稳定后, 改用不含血清的DMEM培养液继续培养, 培养箱中含5 %二氧化碳, 温度为37 ℃。在SH-SY5Y 细胞中加入10 μmo l·L-1 的Aβ25-35 , 培养48 h 。为观察肉苁蓉对Aβ25-35 毒性作用的影响, 先分别加入0 .1 mg·L-1 及1 mg ·L -1 肉苁蓉水提物培养24 h 后, 再加入Aβ25-35 培养48 h 。每个实验组均设3 个复孔, 重复3 次实验。

2.3 　3-4 , 5-二甲基噻唑-2 , 5-二酚四唑溴化物(3-(4 , 5-dimethy lthiazo l-2-yl)-2 , 5-diphen-yl tet razoliumbromide , MTT)测定　为筛选肉苁蓉的安全浓度, 选择0 .05 ～ 5 mg·L-1 质量浓度处理SH-SY5Y细胞后24 h 后测定M TT 还原率, 以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。

2.4　脂质过氧化水平的测定　脂质过氧化中间产物丙二醛可与硫代巴比妥酸(thibabituric acid, TBA)缩合, 形成红色产物, 在532 nm 处有最大吸收峰。收集培养神经细胞的培养液, 测定丙二醛含量。

2.5　尼古丁受体亚单位蛋白表达测定　参照Guan等[ 7] 的方法进行提取细胞膜蛋白及用西印迹方法检测α3 ,α7 nAChR 蛋白水平。以Labworks 软件分析结果时以β-actin 蛋白条带作为内参照, 计算3 、7nAChR 蛋白条带与β-actin 蛋白条带像素灰度的百分比值作为α3 、α7 nAChR 蛋白表达的相对水平比。

2.6 　统计学分析　每组所得结果用 x ±s 表示, 结果用S PSS 12 .0统计软件进行单因素方差分析。

3　结果

3.1 　肉苁蓉安全浓度筛查　肉苁蓉水提物质量浓度大于3 mg·L-1时SH-SY5Y 神经细胞MT T 还原率出现下降趋势, 在0 .5 ～ 3 mg·L-1 范围时细胞MT T 还原率无明显变化, 表明该浓度对细胞毒性作用较小。因此选择0 .1 mg·L -1及1 mg·L -1作为本次研究肉苁蓉的选用浓度。

3.2　肉苁蓉处理后MTT 还原率　肉苁蓉处理后MTT 还原率测定发现, 10 μmol·L-1Aβ25-35 处理细胞后引起MTT 还原率明显降低;0 .1 mg ·L-1 及1 mg·L-1 肉苁蓉水提物处理细胞不影响细胞功能;而用肉苁蓉水提物预处理细胞后可明显减弱Aβ25-35对细胞的毒性作用,Aβ25-35 组与不同浓度肉苁蓉水提物与Aβ25-35联合处理组之间的差异有统计学意义, 随肉苁蓉水提物使用浓度的增加, 该对抗作用越明显。

3.3 　烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白表达水平　烟碱型乙酰胆碱受体α3 及α7 亚单位蛋白表达水平结果表明, 10 μmo l·L-1 Aβ25-35 处理细胞后引起α3及α7 nAChR 蛋白质表达水平明显降低;单纯肉苁蓉水提物处理细胞可上调α3 及α7 nACh R 蛋白表达水平, 且对于α7 受体的上调作用随着浓度增加该作用越明显, 对于α3 受体的作用浓度差别不大;用肉苁蓉水提物预处理细胞后可减弱Aβ25-3 5对细胞尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平的下调作用,

Aβ25-35组与肉苁蓉水提物与Aβ25-35 联合处理组之间的差异有统计学意义。

3.4 　脂质过氧化代谢产物丙二醛水平　结果表明,10 μmo l·L -1Aβ25-35 处理细胞后引起细胞脂质过氧化产物丙二醛水平明显升高;用肉苁蓉水提物处理不影响丙二醛含量;而肉苁蓉水提物预处理细胞后可减弱Aβ25-35 所引起的脂质过氧化水平升高, 此作用亦随着肉苁蓉使用浓度的增加而增强。

4　讨论

大量研究已经证明在AD 脑组织中老年斑的主要成分Aβ 是由其前体蛋白(APP)经β-和γ-分泌酶水解后形成的, 具有一定的神经毒性作用。近来也有研究表明[ 8] ,Aβ 的损伤作用是AD 发生发展的首要因素, 其损伤机制之一是通过增强氧化应激反应和释放自由基产物, 从而引起神经元受损。本研究用Aβ25-35 处理来源于人类的SH-SY5Y 神经细胞,模拟AD 患者脑内神经细胞的病理过程, 以此作为肉苁蓉体外研究的类AD 细胞模型。研究结果显示, 与对照组相比, Aβ25-35处理组SH-SY5Y 神经细胞的MT T 还原率明显降低, 丙二醛水平明显升高,进一步证实Aβ25-35 可通过诱导氧化应激引起神经细胞的损伤。实验还发现肉苁蓉能对抗Aβ25-35引起的脂质过氧化水平的升高, 具有很好的抗氧化作用。肉苁蓉预处理的SH-SY5Y 神经细胞能够对抗Aβ25-35 引起的MT T 还原率降低, 进一步表明肉苁蓉具有抗Aβ25-35引起的神经细胞毒性的作用。烟碱型乙酰胆碱受体是神经系统中一类非第2信使介导性神经递质结合的离子通道, 与学习和记忆关系密切, 是一类明确的具有神经保护功能的受体, 其减少与AD 的发生有关[ 9] 。AD 患者脑内烟碱型乙酰胆碱受体-配体结合率降低, 其亚基的蛋白表达水平也降低[ 10] 。目前寻找可上调nAChR 受体表达且副作用小的药物是治疗AD 药物研究的方向之一。在SH-SY5Y 神经细胞中, α3 和α7 是主要的尼古丁受体亚类。本研究中, 通过测定α3 和α7nAChR 蛋白水平发现, Aβ25-35 能够明显降低α3 、α7亚单位蛋白的表达。肉苁蓉能够明显地上调α3 和α7 nACh R 蛋白的表达水平, 且能对抗Aβ25-35 所导致α3 、α7 亚单位蛋白的表达降低。这样的作用说明在治疗AD 药物的选择中肉苁蓉可能具有重要的作用。

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