[摘要] 目的 研究肉苁蓉总苷(GCs)对脂多糖（LPS）诱导的BV2 细胞炎症反应的机制。方法 采用小鼠小胶质细胞BV2 细胞株作为研究对象。将BV2 细胞随机分为对照组、LPS 组和GCs 组。对照组正常培养。LPS 组用 LPS 诱导BV2 细胞建立炎症模型。GCs 组加入不同浓度GCs 与LPS 共培养。CCK8 检测各组细胞活性。qRT-PCR 检测各组炎症因子IL-1β、COX-2 mRNA 的表达，WB 检测SIRT1、NF-κB 蛋白水平的变化。结果 CCK8 结果显示，GCs 各组细胞活性与对照组之间无差异（P>0.05），LPS 组细胞活性显著低于对照组和GCs 各组（P<0.05）。qRT-PCR 结果显示，LPS 组IL-1β、COX-2 mRNA 表达水平显著高于对照组和GCs 与LPS 共孵育组（P<0.05）。WB 结果表明与对照组和GCs 各组相比，LPS 组SIRT1 表达下调（P<0.05），磷酸化p65 的表达上调（P<0.05）。结论 GCs 能够抑制LPS 诱导的BV2 细胞的炎症反应，其机制可能与SIRT1/NF-κB 信号通路相关。

[关键词] 肉苁蓉总苷；脂多糖；BV2 细胞；SIRT1/NF-κB

围术期神经认知紊乱(perioperative neurocognitive disorders,PND)与神经炎症反应密切相关，高龄、手术创伤应激、麻醉药物等均可能诱发神经炎症反应，小胶质细胞活化是其重要的推进过程，在PND 的发生和发展中发挥重要的作用[1]。

肉苁蓉总苷(general cistanosides,GCs)的化学成分主要包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类等，具有明确的抗氧化和神经保护作用[2, 3]。本实验以LPS 诱导的BV2 细胞炎症反应模型为基础，采用GCs 干预，通过检测IL-1β、COX-2、SIRT1、NF-κB-p65 的变化，研究GCs 对围术期神经炎症的影响，为肉苁蓉的进一步开发应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠小胶质细胞株（BV2）由上海复旦大学附属肿瘤医院朱敏敏教授惠赠。GCs（西安昊轩生物科技有限公司）；脂多糖（美国 Sigma 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组BV2 细胞以高糖DMEM+10 %FBS 为细胞培养基，置于37℃，5 %CO2的细胞培养箱中培养。BV2 细胞随机分为对照组、LPS 组和不同浓度GCs组。将LPS 加到96 孔板中，使其终浓度为1 ug/mL, 依据分组加入不同浓度

的GCs，与LPS 共培养。

1.2.2 CCK8 检测细胞活性细胞接种于96 孔板，待贴壁后更换培养基，不同浓度GCs（5 ug/mL、25 ug/mL、50 ug/mL、75 ug/mL）和终浓度为1 ug/mL LPS 共培养，加入CCK8，酶标仪测定吸光度值并计算细胞活性。

1.2.3 qRT-PCR 检测各组炎症因子IL-1β、COX-2 的mRNA 表达用试剂盒提取RNA，并按照说明书进行反转录。qRT-PCR 实验数据运用2-△△Ct 公式计算。

1.2.4 WB 检测各组SIRT1、NF-κB-p65 蛋白表达情况按照说明书提取蛋白,电泳，转膜，一抗孵育，加入二抗,采用化学发光法进行显影，运用ImageJ 软件分析灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0 软件进行统计分析，计量资料采用均数加减标准差（ x ± s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 GCs 对BV2 细胞活性的影响同对照组相比，不同浓度的GCs 对BV2 细胞的活性未见明显的影响。结果见图1。

2.2 GCs 对LPS 诱导的BV2 细胞活性的影响结果表明，与对照组相比，LPS 组细胞活性明显降低（P <0.01）; 与LPS组相比，GCs 组的细胞活性明显升高（P<0.05）。结果见图2 。

2.3 GCs 对LPS 诱导BV2 细胞炎症因子IL-1β，COX-2 mRNA 表达的影响qRT-PCR 结果表明，与对照组相比，LPS 组中IL-1β，COX-2 的mRNA表达明显提高（P<0.05）。GCs 与LPS 共孵育各组炎症因子的mRNA 的表达显著下降（P<0.05）。结果见图3。

2.4 GCs 对LPS 诱导的BV2 细胞SIRT1/NF-κB 通路关键蛋白表达的影响WB 结果表明，LPS 诱导后，P-P65 的表达明显上升（P<0.05），SIRT1的表达明显降低（P<0.05）。GCs 与LPS 共孵育各组P-P65 的表达明显降低，

S IRT1 的表达升高（P<0.05）。这在GCs 高剂量组更为明显。见图4。

3 讨论

PND 是常见的中枢神经系统并发症。目前认为神经系统炎症是PND 的主要发生机制之一。手术应激、全麻药物、衰老等可诱发神经系统炎症触发并加重PND。因此，围术期神经保护、神经系统炎症管理可能有助于改善PND。目前研究表明，GCs 中的松果菊苷、毛蕊花糖苷等成分具有明确的抗氧化及神经保护的作用，但具体机制尚不明确。本研究以BV2 为研究对象，在细胞水平探讨了GCs 对 NF-κB 信号通路的影响。实验结果表明，本实验采用的GCs 浓度对细胞活性没有影响，LPS 组细胞活性降低及炎症因子增加表明神经炎症造模成功，LPS 与GCs 共同孵育的结果表明GCs 可以改善炎症状态下的细胞活性。SIRT1 是一种进化高度保守的NAD+依赖性蛋白去乙酰化酶，与炎症反应密切相关。 2004 年Yeung 等人的研究［4］首次证实SIRT1 可与 NF-κB 的RelA/p65 亚基相结合影响NF-κB 的转录活性，抑制 NF-κB 介导的炎症信号通路。本研究结果发现LPS 诱导的BV2 细胞中SIRT1 表达降低，NF-κBp-65 的磷酸化水平升高，下游炎症因子的表达增加。GCs 与LPS 共孵育组细胞内SIRT1 表达上调，NF-κB P65 的磷酸化水平下降，下游炎症因子的表达减少。结合上述实验结果，我们推测GCs 可能通过激活BV2 细胞中的SIRT1/NF-κB 信号通路来抑制炎症因子的表达。本实验的不足之处是未研究GCs 对经SIRT1 抑制剂处理后的细胞中的炎症介质产生的影响。这有待于我们下一步进行探究。

综上，我们的研究表明：GCs 可能通过激活SIRT1/NF-κB 信号通路，进而抑制LPS 诱导的BV2 小胶质细胞炎症反应，为后期开发肉苁蓉在神经炎症相关疾病的应用提供了参考。

参考文献

[1] Dj C, M B, R Y, et al. The memory effects of general anesthesia persist forweeks in young and aged rats.[J]. Anesthesia and analgesia,2003, 96(4):1004-1009.

[2] Yh W, Zh X, S T, et al. Echinacoside Protects against 6-Hydroxy dopamine-Induced Mitochondrial Dysfunction and Inflammatory Responses in PC12Cells via Reducing ROS Production.[J]. Evi Based Complement AlternatMed, 2015,2015:189239.

[3] Jk W, Lc W, Y J, et al. [Neuroprotective effects and mechanism of ethanolextract of Cistanche tubulosa against oxygen-glucose deprivation/ reperfusion].[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2019,44(13): 2686-2690.

[4] Yeung F, Hoberg JE, Ramsey CS, et al. Modulation of NF-kappaB-dependent transcription and cell survival by the SIRT1 deacetylase. EMBOJ. 2004, 23(12): 2369-80.