［关键词］肉苁蓉/ 化学；多糖类；光谱分析

［摘 要］ 目的：研究从中药肉苁蓉（Cistanche deserticola）肉质茎中得到的中性多糖CDP-4 的化学结构。方法：利用化学方法和谱学方法分析其结构特征。结果：CDP-4 的平均相对分子质量为1. 4 X 104，由葡萄糖组成，由1，4-linkage glcp 和1，6-linkage glcp 以31 1 的比例连接组成。结论：CDP-4 为直链葡聚糖，空间结构与直链淀粉不同，为新的葡聚糖。

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY. C. Ma 的带鳞叶的肉质茎，又名金笋、地精。始载于《神农本草经》，列为上品。本品具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，在历代补肾阳处方中使用频度最高。文献报道肉苁蓉含有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类以及多糖类成分［1，2］，肉苁蓉多糖具有调节免疫、抗肿瘤、延缓衰老等药理作用。为了阐明肉苁蓉多糖的结构特征和生物活性，我们对肉苁蓉多糖进行了系统的研究，本文报道从肉苁蓉多糖的免疫活性部位中分离得到的CDP-4 多糖的结构特点。

1 实验部分

1. 1 仪器和材料

仪器有Agilent 1100 高效液相色谱系统，ELSD检测器，Shodex KS-805 凝胶色谱柱；GC 色谱仪为Agilent HP6890N 型（ FID 检测器）。GC-MS 用Finnigan Trace GC-MS 仪，核磁共振波谱仪为INOVA-500 型，红外光谱仪为Perkin Elmer 599B 型，UV光谱仪为UV-2401（ PC）S220V 型，WZZ-1S 数字式自动旋光仪为上海精密科学仪器有限公司产。单糖对照品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸）均为分析纯，购于Merck 公司。多糖相对分子质量测定用标准品Dextran T 系列，均为pharamacia 公司产品。硼氢化钠、三氟醋酸和DMSO 等均为AR 级，其他试剂为国产。肉苁蓉药材采自内蒙古阿拉善左旗，经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为列当科植物荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma 的肉质茎。

1. 2 提取和分离

肉苁蓉药材1. 5 kg，用95%（体积分数）乙醇提取3 次，脱脂，过滤，药渣于室温下置通风处晾干。然后用冷水浸泡3 次，浸泡时间为8 h，合并水提液，浓缩至适当的浓度，加入无水乙醇使该溶液乙醇浓度为80%，进行醇沉，沉淀物加蒸馏水溶解至适当的浓度后用sevage 法脱蛋白［3］，水溶液减压蒸干，蒸馏水溶解后进行透析。先用对流水透析3 d，再用蒸馏水透析2 d，浓缩至干得粗多糖26. 0 g。首先经DEAE-纤维素分离，以0 ~ 2 mOI / L NaCI 梯度洗脱，其中蒸馏水洗脱部位经Sephedex G-150 和SephacryS-300 柱色谱，得到均多糖CDP-4（320. 2 mg）。

1. 3 结构鉴定

1. 3. 1 纯度及相对分子质量测定［4，5］ 先采用标准葡聚糖Dextran T 系列制作标准曲线，然后根据多糖样品在相同色谱条件下的洗脱体积或保留时间，用标准曲线计算该样品的相对分子质量。流动相为蒸馏水，流速为1 mI / min，柱温为60 C。

1. 3. 2 糖组分分析 取5. 0 mg CDP-4，放入10 mL试管中，加入三氟醋酸（TFA）4 mL，充N2后封管，110 C下水解2 h。将水解液减压蒸干（ < 40 C），除尽TFA，再加入蒸馏水约0. 5 mL 使样品溶解。取少量样品液在5%（质量分数）碳酸氢钠硅胶板上分析，初步检测样品所含单糖残基，并验证是否含有糖醛酸。展开剂为正丁醇= 乙酸乙酯= 异戊醇= 甲酸= 吡啶= 3. 5= 10= 6= 3. 5= 3（体积比），苯胺-邻苯二甲酸显色［6］。完全酸水解产物用NaBH4还原，经醋酐乙酰化制备阿尔迪醇酯衍生物后进行GC 分析。

1. 3. 3 甲基化分析 取8 mg CDP-4 按Ciucanu法［7］甲基化，IR 检测CDP-4 甲基化完全后，将甲基化产物以甲酸解聚，加入4 mL TFA，充N2后封管，110 C下水解2 h 后用NaBH4还原，醋酐乙酰化制备阿尔迪醇酯衍生物后进行GC-MS 分析。

1. 3. 4 过碘酸盐氧化和Smith 降解反应 取7. 6mg CDP-4 溶解在25 mL 0. 01 mOI / L NaIO4中，在4C避光氧化，每天依时取样，用紫外分光光度计在223 nm 处测定消耗量，直至不再氧化为止。在氧化完全的反应液，加乙二醇分解未反应的NaIO4，透析24 h，浓缩后用NaBH4还原，放置12 h，用乙酸调至pH = 5，透析24 h，低温冷冻至干。用2 mOI / L TFA100 C密封水解8 h，中和后浓液进行纸层析，展开剂为正丁醇= 乙酸乙酯= 异戊醇= 甲酸= 吡啶=3. 5= 10= 6= 3. 5= 3（体积比），苯胺-邻苯二甲酸显色。

1. 3. 5 部分酸水解 28. 2 mg CDP-4 溶解于0. 1mOI / L TFA 溶液中，充氮封管，100 C反应1 h，透析。袋内部分用sephacryI S-300 凝胶柱纯化，得次级多糖组分（CDP-4-1），该次级组分进行甲基化3次、甲酸水解、TFA 水解、NaBH4还原及醋酐乙酰化制备阿尔迪醇酯衍生物后进行GC-MS 分析，分析方法同前（ 表1）。袋外部分用sephadex G-25 凝胶柱纯化，得到1 个相对分子质量小的多糖组分（CDP-4-2-1），对其进行甲基化、甲酸水解、TFA 水解、NaBH4还原、醋酐乙酰化制备阿尔迪醇酯衍生物后进行GC-MS 分析，分析方法同前（表1）。

   

   
   

1. 3. 6 多糖和碘的颜色反应 在多糖水溶液（1g / L）1 mL 中加入碘试剂1 mL 及水1 mL，用水作参比，测定200 ~ 700 nm 的吸收光谱。

1. 3. 7 NMR 测定 取56 mg CDP-4 加入0. 5 mLD2O 放置过夜，蒸干后再加入0. 5 mL D2O 溶解，用核磁共振仪INOVA-500 型测定13 C NMR，1H NMR，HMOC 和HMBC。

2 结果与讨论

CDP-4 为无色粉末，HPGPC 分析结果显示为单一对称峰，表明CDP-4 为均一多糖。用标准葡聚糖系列制作矫正曲线，测得其相对分子质量为1. 4 X 104。红外光谱无810 及870 cm - 1 特征吸收峰，表明不含甘露糖。通过LO ry 方法［8］测定，表明CDP-4 不含蛋白质。茚三酮反应阴性，进一步确证CDP-4 不含蛋白质。以CDP-4 完全酸水解产物进行TLC 分析，与标准单糖对照，苯胺邻苯二甲酸显色，结果表明该多糖仅在葡萄糖标准品相同的Rf

值位置有斑点出现。将CDP-4 完全酸水解产物制备阿尔迪醇酯衍生物进行GC 分析，结果表明该多糖只含有葡萄糖，其结果与TLC 分析的结果相同。

将CDP-4 进行甲基化3 次，IR 表明3 000 ~3 600 cm - 1 处强而宽的羟基吸收峰基本消失，而2 940 cm - 1处甲基的特征吸收峰显著增强，说明已经完全甲基化。完全甲基化产物经甲酸解聚、酸水解、水解产物还原、醋酐乙酰化，制备部分甲基化阿尔迪醇酯衍生物。GC-MS 分析结果表明，CDP-4 是由1，4-linkage glcp 和1，6-linkage glcp 组成，它们的物质的量比是31 1，没有分支链残基，说明CDP-4 是直链葡聚糖。

高碘酸氧化产物经降解，产物水解衍生，进行纸层析检测含有甘油、葡萄糖和少量的赤藓醇，说明CDP-4 含有1-4 和1-6 键型的葡萄糖。这与CDP-4甲基化的结果相符。从部分酸水解结果可以看到在0. 1 mol / L TFA 部分酸水解样品经透析后获得两部分多糖：相对分子质量较大多糖CDP-4-1 和较小多糖CDP-4-2。CDP-4-2 经sephdex G-25 纯化后得到CDP-4-2-1，HPLC 检测CDP-4-2-1 为单一对称峰。CDP-4-1 和CDP-4-2-1 的甲基化结果见表1，从甲基化结果可以看到CDP-4-1 与CDP-4-2-1 都是由1，4-linkage glcp 和1，6-linkage glcp 组成，与CDP-4 的甲基化结果基本相同，CDP-4-1 和CDP-4-2-1 与CDP-4有相同的结构特征。在CDP-4 的13 C NMR 中，S 100. 3、S 98. 4、S96. 4处的吸收为葡萄糖端基碳的吸收，表明所含葡萄糖都是以O 吡喃型存在［9］。在HMOC 谱我们可以看到，S 5. 3 ~ S 5. 4 与S 100. 3 相关，S 4. 9 与S98. 4 相关。根据HMOC、HMBC、TOCSY 和COSY 可以观察到，S 100. 3 和S 77. 4 分别为1，4-linkage glcp的C-1 和C-4 信号［9］，S 98. 4 和S 66. 2 分别为1，6-linkage glcp 的C'-1 和C'-6 信号［10］。此外，在1HNMR 谱中，S 5. 3 ~ S 5. 4 与S 4. 9 积分物质的量比为6. 9 1 2. 0，说明1，4-linkage glcp 与1，6-linkageglcp 以31 1 的比例存在，与甲基化的结果基本相同。同时，在HMBC 谱中有1，4-linkage glcp 的C-4 和1，6-linkage glcp 的H'-6 相关信号以及1，4-linkage glcp的C-4 和H-1 的相关信号，表明1，6-linkage glcp 的C'-6 连接在1，4-linkage glcp 的C-4 位，而1，4-linkageglcp 之间是以1、4 的方式连接。其他信号的归属根据HMOC 和HMBC 进行。以上分析结果说明

CDP-4 是1，4-linkage glcp 与1，6-linkage glcp 以31 1的比例组成的葡聚糖。

此外，CDP-4 水溶液与碘反应后呈无色溶液，而且在200 ~ 700 nm 之间几乎没有吸收，说明该多糖有与直链淀粉完全不同的空间结构。

参考文献

1 Karasawa H，Kobayashi H，Takizawa N，et al. Studies on the constituentsof Cistanche herba，W Isolation and structure of a new phenylethanoidglycoside，Cistanoside G［ J］. Yakugaku Zasshi，1986，

106：721 - 724

2 Yoshizawa F，Deyama T，Takizawa N，et al. The constituents ofCistanche tubulosa（SCHRENK）Hook. f. I. Isolation and structuresof a new phenylethanoid Glycoside and a New Neolignan Glycoside

［J］. Chem Pharm Bull，1990，38：1927 - 1930

3 Navarini L，Gilli R，Gombac V，et al. Toffanin R. Polysaccharidesfrom hot water extracts of roasted coffea arabica beans：isolation andcharacterization［J］. Carbohydrate Polymers，1999，40：71 - 81

4 魏远安，方积年. 高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量［J］. 药学学报，1989，24：532 - 536

5 Alsop RM，Vlachogiannis GJ. Determination of the molecular weightof clinical dextran by gel chromatography on TSK PW TYPE columns［J］. Chromatogr，1982，246：227 - 240

6 张惟杰. 复合多糖生化研究技术［M］. 上海：上海科学技术出版社，1987. 65 - 67

7 Needs PW，Selvendran RR. Avoiding oxidative degradation duringsodium hydroxide / methyl iodide-mediated carbohydrate methylationin dimethyl sulfoxide［J］. Carbohydr Res，1993，245：1 - 10

8 Andre B，David W. Assay of proteins in the presence of interferingmaterials［J］. Analytical Biochemistry，1975，250：6 - 19

9 Bozena K，Anna E，Radna N. Characterization of lignin-carbohydratefractions isolated from the wood parasite Cistanche deserticola.Y. C. Ma［J］. Holzforschung，1999，53：33 - 38

10 Deng CH，Yang XL，Gu XM，et al. A B-d-glucan from sclerocia ofPleurotus tuber-regium（Fr. ）Sing［J］. Carbohydr Res，2000，328：629 - 633