摘要:目的　观察肉苁蓉多糖( CDPS) 对巨噬细胞的活化作用。方法　采用中性红法测定吞噬活性;Griess试剂法测定NO释放量;L929 细胞法及小鼠胸腺细胞法测定TNF-α及IL-1释放。结果　CDPS在6.25 ～ 50 mg· L-1剂量范围内可剂量依赖性地增强BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力和促进NO释放;在2.8 ～ 100 mg· L-1剂量范围内可使正常和免疫抑制的RAW264.7细胞NO释放明显增加;在0.56 ～ 7.2 mg· L-1 或3.6 ～ 10 mg· L-1 范围促进

RAW264.7细胞TNF-α或IL-1产生, 均具有良好的量效关系。结论　CDPS可明显提高巨噬细胞吞噬及分泌功能, 活化巨噬细胞。肉苁蓉免疫增强作用可能与此有关。

关键词:肉苁蓉多糖;巨噬细胞;吞噬活性;NO;TNF-α;IL-1;

植物多糖因其普遍具有的免疫调节作用及其相对低毒的特点引起人们的广泛关注[ 1], 多种证据显示植物多糖发挥免疫调节作用的一条重要途径是活化巨噬细胞, 激活其吞噬活性, 增加NO、TNF-α、IL-1等的分泌以发挥巨噬细胞对肿瘤细胞和微生物的细胞毒作用[ 2] 。肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉( CistanchedeserticolaY.C.Ma)的带鳞片的干燥肉质茎, 具有广泛的药理作用。其水煎物可明显提高巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数[ 3], 但迄今未见肉苁蓉多糖( Cistanche deserticola polysaccharide,CDPS)对巨噬细胞活化报道, 本文较系统的考察了CDPS对巨噬细胞活化相关指标的影响。

1　材料与方法

1.1　药品与试剂　CDPS由医科院药植所植化室提供, 多糖含量87%。脂多糖( LPS), 地塞米松( Dex) , MTT均为Sigma公司产品。胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶均系Gibco公司产品。其它试剂为国产分析纯。

1.2　动物与细胞株　BALB/c及C3 H/Hej小鼠( SPF级)均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, RAW264.7细胞株购于美国ATCC公司, L929细胞株由中国典型培养物保藏中心提供。

1.3　仪器　MultiskanAscent酶标仪, 美国ThermoElectron公司产品。雷磁PHS-3B型精密pH计, 上海精密科学仪器有限公司。Napco5410型二氧化碳孵箱, 美国NAPCO。BCN-1360型超净工作台, 北京东联哈尔仪器制造有限公司。XDS-1B倒置显微镜,重庆光电仪器公司。

1.4　方法

1.4.1　CDPS对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响[ 4] 　按文献[ 5] 法分离培养小鼠腹腔巨噬细胞, 将细胞接种于96孔细胞板, 贴壁后加入不同浓度CDPS(正常对照孔或阳性孔加等体积的培养基或LPS)孵育24 h, 弃上清, 加质量浓度为0.75g· L-1中性红200 μl/孔, 置37℃, 5% CO2 孵箱(后简称孵箱)培养30 min后弃上清, Hanks液200 μl/孔洗3遍, 加细胞裂解液( 1 mol· L-1醋酸与等体积无水乙醇的混合液) 200 μl/孔, 充分振摇3 min,37℃孵育1 h, 在酶标仪570 nm波长处测定吸光度。按下公式计算吞噬增加率/% =(给药孔吸光度-对照孔吸光度) /对照孔吸光度×100%

1.4.2　CDPS对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO释放的影响　小鼠腹腔巨噬细胞接种于96孔细胞板中, 贴壁后加入不同浓度CDPS(正常对照孔或阳性孔加等体积的培养基或LPS) , 置孵箱中培养24 h,Griess法[ 5] 测定上清中NO2

-的含量, 用以反映NO分泌水平。

1.4.3　CDPS对正常及免疫抑制的RAW264.7 细胞NO释放的影响　将RAW264.7细胞按2 ×105个/孔接种于96 孔板, 于孵箱中孵育24 h后弃上清, 每孔按100 μl/孔加无血清DMEM培养基(免疫抑制组DMEM含30 nmol· L-1的Dex) , 孵箱孵育2h后, 正常及免疫抑制细胞均加入100 μl/孔不同浓度CDPS药液, 阳性孔加入100 μl/孔0.02 mg· L-1( 终浓度0.01mg· L-1) LPS, 置孵箱中培养24h,Griess法测定NO分泌水平。

1.4.4　CDPS对RAW264.7细胞产生TNF-α和IL-1的影响　将RAW264.7细胞按2 ×105 个/孔接种于96孔板, 于孵箱中孵育24 h后弃上清, 每孔按100 μl/孔加入不同浓度CDPS药液, 阳性孔加0.02mg· L-1 LPS, 继续培养24 h, 收集上清, 分别采用C3 H/Hej小鼠胸腺细胞法[ 6, 7] 及L929细胞法[ 8, 9]测定上清中TNF-α及IL-1。

　　TNF-α测定:取对数生长期的L929 细胞, 按2×104 个/孔种于96孔板中, 于孵箱中培养24 h, 按100 μl/孔加入用含0.2 mg· L-1放线菌素D的无血清培养液稀释的待测样品(细胞上清) , 继续培养20h, MTT法测定细胞死亡率。设正常对照组死亡率为0, 其它各组与正常对照组比较, 计算死亡率=( 1-给药组吸光度/正常对照组吸光度) ×100%, 以死亡率表示TNF-α的生物学活性, 死亡率越高表明TNF-α的生物学活性越强, 细胞产生的TNF-α也就越多。

　　IL-1测定:将C3 H/Hej小鼠胸腺细胞按2 ×106个/孔接种于96 孔板, 孵箱中孵育24 h后弃上清,按200 μl/孔加入含3 mg· L-1 ConA的无血清培养液稀释的待测样品(细胞上清)后继续培养20 h,MTT法测定细胞增殖率, 设正常对照组增殖率为0,其它各组与正常对照组比较, 计算增殖率=(给药组吸光度/正常对照组吸光度-1) × 100% , 以增殖率表示IL-1的生物学活性, 增殖率越高表明IL-1生物学活性越强, 细胞产生的IL-1也就越多。

1.5　统计分析　实验数据采用MicrosoftExcel软件进行t检验, 实验结果采用 x±s表示。

2　结果

2.1　对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和NO释放的影响　结果表明, 6.25 mg· L-1 CDPS可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞对中性红的吞噬力及促进NO释放, 且随剂量增高, 作用增强。显示良好的量效关系( Tab1) 。

2.2　对正常和免疫抑制的RAW264.7细胞NO释放影响　如Fig1所示, DEX可明显抑制RAW264.7细胞NO分泌, 对正常细胞, NO分泌量降至Griess试剂检测限以下, 而对活化巨噬细胞( LPS刺激)也明显抑制其分泌量。CDPS对正常或抑制状态细胞均有明显促进NO释放作用, 且具明显的量效特征。

2.3　对RAW264.7 细胞TNF-α释放影响　0.56mg· L-1 CDPS即可明显增加RAW264.7细胞TNF-α释放, 且随CDPS剂量增加释放量也随之加大, 量效关系明显( Tab2) 。

2.4　CDPS对RAW264.7 细胞IL-1 释放影响　3.6 mg· L-1 CDPS即可明显促进RAW264.7 细胞IL-1的释放, 3.6 ～ 10 mg· L-1剂量区间巨噬细胞IL-1释放量明显高于对照组, 且具量效关系( Tab3) 。

4　讨论

　　巨噬细胞是重要的免疫调节和效应细胞, 通过吞噬杀伤微生物、抗原提呈和分泌多种细胞因子等作用控制机体的炎症反应和免疫应答。植物多糖的免疫调节作用与活化巨噬细胞密切相关[ 2] 。巨噬细胞活化表现为吞噬功能增强, 一些具调节免疫应答的细胞因子合成及分泌增加, 以此对入侵的病原微生物或肿瘤细胞等发挥吞噬或细胞毒作用。已知巨噬细胞可产生NO, 而NO的一个最突出的作用是增强巨噬细胞对抗病毒、细菌、真菌、肿瘤细胞等作

用。TNF-α不仅直接参与抗肿瘤作用, 还可调节NK细胞等免疫细胞的活性[ 10] 。IL-1可活化淋巴细胞诱导免疫应答及协同刺激胸腺细胞增生等作用。因此实验选择了以上3种细胞因子作为观察对象。

　研究表明CDPS对巨噬细胞的吞噬功能及NO、TNF-α、IL-1的释放呈现明显增强作用, 对免疫抑制的RAW264.7 细胞NO的释放也有明显的促进效果。这些结果显示肉苁蓉的免疫增强作用与其所含多糖的巨噬细胞活化作用密切相关, CDPS可能是肉苁蓉提高免疫力主要有效部位。此外, 我们还注意到, CDPS在促细胞因子释放上存在不同的量效区间, CDPS有效剂量大小依次为NO>IL-1 >TNF-α。巨噬细胞对CDPS促TNF-α生成最敏感这一结果是否与TNF-α可触发其他细胞因子的生成[ 10] 相关值得进一步研究。

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