[摘　要]　目的: 研究肉苁蓉多糖( CDPS)的免疫活性作用及其体外免疫调节作用的机制。方法: 采用噻唑蓝比色法(M T T)观察CDPS体外对ISO、DEX、TN F-β 抑制小鼠胸腺淋巴细胞增殖的调节作用;采用流式细胞仪进行了CDPS对细胞周期及其胞内Ca2+ 的测定。结果: CDPS在较高浓度能对抗ISO、DEX对淋巴细胞增殖的抑制作用,及对抗高浓度TN F-β 对淋巴细胞增殖的抑制作用,协同低浓度TN F-β 对淋巴细胞的增殖促进作用; 100 μg /m l、200μg /ml CDPS均能使分裂期的细胞明显增加; 较高浓度( 100μg /ml)的CDPS对小鼠胸腺细胞内Ca 离子浓度有明显的促进升高作用。结论: CDPS能促进细胞进入分裂期,并推断其对小鼠胸腺淋巴细胞增殖的促进作用与其促进

小鼠胸腺淋巴细胞内钙释放有关。

[关键词]　肉苁蓉/药理学; 多糖类/药理学; 淋巴细胞增殖; 细胞周期; Ca2⁺

肉苁蓉(Cistanche Deserticola Y C Ma )是我国稀有的名贵中药材,在《神农本草经》中被列为上品,具有益精血、补肾助阳、润肠通便、延缓衰老之功能。近代药理学研究表明,它能提高机体免疫功能,促进DN A合成, 增强体力,提高智力,具有明显的抗衰老作用[1 ]。作者研究了肉苁蓉的一种多糖组分CDPS对小鼠淋巴细胞免疫功能的调节作用。

1　材料与方法

1. 1　试剂与药品　RPMI 1640培养基: GIBCO公司; HEPES: FARCO公司; L-谷氨酰胺:上海东风试剂厂;青霉素、链霉素: 华北制药厂;刀豆球蛋白( ConA)、M T T: SIGMA公司; 植物血凝素( PHA): 上海市医学化验所; 异丙肾上腺素( ISO ): 上海市天丰药厂; 巯基乙醇: Fluka公司; 新生小牛血清: 四季青生物工程公司; 地塞米松( DEX )为浙江大学医学院附属第一医院马量医师赠送; 肿瘤抑制因子( TN F)为浙江大学生命科学院细胞教研室余越汉老师提供;其余试剂均为国产分析纯。

1. 2　实验动物　ICR小鼠,雄性, 6～ 8周龄,体重18～ 20 g , 22只,购于浙江省实验动物中心。

1. 3　肉苁蓉多糖的提取　肉苁蓉多糖由本室自行提取[2 ]: 生药肉苁蓉粉碎后,经热乙醇浸渍,沸水抽提, 乙醇沉淀,中性酶结合Sev ag 法脱蛋白,阴离子DEAE-Sephadex A-50交换层析, Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到肉苁

蓉多糖( CDPS)单一组分。干燥保存,临用前用不完全RPMI1640配成一定浓度,超滤灭菌。

1. 4　脾、胸腺淋巴细胞的制备[3 ]　小鼠脱颈处死,无菌取脾或胸腺,经200目钢网过筛,以含5% 新生小牛血清的Hanks液制成单个细胞悬液, 于1500 r /min, 10 min 离心后, 用0. 01mol /L Tris-N H4 Cl低渗液裂解红细胞1 min

后,再用Hanks 液离心洗涤,最后将细胞悬浮于含10%新鲜小牛血清的RPMI 1640完全培养液(含2 mmol /L L-谷氨酰胺, 100 mmol /L丙酮酸钠, 1 mmol /L巯基乙醇,临用前加入青霉素100 U /ml和链霉素100μg /ml )中,台盼蓝计数,活细胞> 95% ,调整脾细胞浓度为1×106 /ml,胸腺细胞浓度为4× 106 /ml。

1. 5　淋巴细胞增殖反应　按Mo sma nn 法[ 4]改进: 96孔细胞培养板,每孔加入1× 106 /ml脾细胞悬液或4× 106 /ml胸腺细胞悬液100μl及不同浓度的药物100 μl,于5% CO2 , 37℃培养箱中培养72 h,培养结束前4 h,每孔加入

MT T ( 5 mg /ml ) 8 μl, 培养结束时每孔吸去150μl上清,加入0. 5 N盐酸异丙醇150μl,于微量震荡器上轻轻震荡使蓝色结晶完全溶解,在酶标仪上测定OD570,每实验点设为三复孔。

1. 6　对细胞周期影响的测定[5 ]　24孔细胞培养板,每孔加入4× 106 /ml胸腺细胞悬液1 ml,补加各种试剂及多糖溶液至2 ml,于5% CO2 ,37℃培养箱中培养72 h 后, 1500 r /min,离心15 min,弃上清, 沉淀的细胞加入70% 的乙醇固定, 4℃保存备用。测试时,细胞经PBS洗涤两次, 1500 r /min, 离心15 min,弃上清,加入0. 5 ml 0. 1% RNaseA,于4℃酶解30 min后,50μg /ml溴乙碇避光4℃染色30 min,细胞样品在FACSca n f low cytometer 上检测荧光强

度,每一样品收集10000个细胞测试点,数据采用Mul ticycle软件分析。

1. 7　细胞内钙离子浓度的测定[6 ]　同上方法取小鼠胸腺细胞,用不完全RPM I1640培养液悬浮,调其细胞浓度至1× 107 /ml。每实验管加入1 ml的胸腺细胞悬液和1μM Fluo-3AM染液5 μl, 25% F-127 5 μl, 于37℃温育30 min

后,用不完全RPMI1640洗两次, 1500 r /min,离心10 min,弃上清,沉淀的细胞加不同浓度的多糖和Co nA后在FACScan f low cytometer上检测荧光强度,每一样品收集10 000个细胞测试点,数据采用CELLQU EST软件分析。

1. 8　统计学方法用方差分析,细胞周期和钙离子测定采用流式细胞仪自身所带软件分析。

2　结　果

2. 1　肉苁蓉多糖体外对ISO、DEX、TN F-β 抑制小鼠胸腺淋巴细胞增殖的调节　β -肾上腺素受体的激动剂异丙肾上腺素( ISO)和一类肾上腺皮质激素-地塞米松( DEX )有抑制淋巴细胞增殖的作用, CDPS 在较高浓度( 75、125 μg /ml )能对抗ISO、DEX对淋巴细胞增殖的抑制作用( P < 0. 01)。见图1。肿瘤坏死因子( TN F-β )在高浓度时对淋巴细胞的增殖呈抑制作用,而较高浓度的CDPS ( 125 μg /ml )可以对抗TNF-β 的抑制作用, 且协同低浓度TN F-β 对淋巴细胞的增殖促进作用(图2)。

2. 2　肉苁蓉多糖对胸腺淋巴细胞周期的调节

　CDPS 25μg /ml、100μg /ml、200μg /ml三个浓度分别作用于小鼠胸腺淋巴细胞72 h后,经FACS 测定细胞内DN A 含量, 根据公式S+ G2G1+ S+ G2× 100%计算增殖指数( PI )。结果表明, 100 μg /ml、200 μg /ml 均能使分裂期的细胞明显增加,两者的增殖指数( 68. 0% , 56. 6% )均明显高于对照组( 44. 6% ) , 其中200μg /ml组略低于100 μg /ml组, 因为在200 μg /ml浓度时,其对细胞的增殖作用已成下降趋势[7 ]。而25μg /ml组的P I 值( 47. 5% )比对照组无明显增高。

2. 3　肉苁蓉多糖对小鼠胸腺淋巴细胞内钙离子浓度的作用　实验结果表明,较高浓度( 100μg /ml )的CDPS对小鼠胸腺细胞内Ca 离子浓度有明显的促进升高作用,与对照组相比有显著差异( P < 0. 01) , 且与Co nA具有协同作用

( P < 0. 01) ,与作用时间存在一定的效应关系(图3)。

3　讨　论

肉苁蓉俗称“沙漠人参” ,为列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞片的肉质茎,具有补肾阳、益精血、润肠等作用,属于一种能兴奋垂体-肾上腺皮质或有类似肾上腺皮质激素样作用,能调节机体免疫功能的名贵中药。我们先前的研究结果表明, CDPS体外对未经活化或经Con A、PHA活化的胸腺T淋巴细胞均有促进其增殖的作用,结合Con A、PHA是两类T细胞刺激剂,我们认为CDPS是T细胞的免疫佐剂。同时还发现, CDPS较高浓度时可显著提高小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2[7 ]。有人研究发现, 重组体TN F体外可引起正常鼠和人T淋巴细胞簇的凋亡,这种作用可潜在地被IL-2、IL-1、IFN-γ、IL-4等抑制[8 ]。地塞米松( DEX)可通过抑制淋巴细胞表达和分泌IL-2,及下调高亲和力的IL-2R生成来抑制淋巴细胞增殖。本实验发现,较高浓度CDPS可对抗高浓度TN F-β 对淋巴细胞增殖的抑制作用,协同低浓度TN F-β 对淋巴细胞的增殖促进作用,且能对抗ISO、DEX对淋巴细胞增殖的抑制作用。这些作用正是通过CDPS促进T淋

巴细胞的增殖,并由T细胞自分泌IL-2等细胞因子来完成的。近几年来,人们对植物多糖的免疫药理作用研究较多,但对多糖的免疫调节机理的研究很少,尤其是对多糖作用于淋巴细胞的以Ca2+为第二信使的信号传导途径的研究一直未见报道,本实验进行了这方面的初步研究。胞内信号分子包括cAM P、Ca2+ 、IP3、DG、cGMP等,其中Ca2+ 对细胞有极其重要的生理作用,细胞内Ca2+ 浓度的升高,是淋巴细胞激活和增殖中早期呈现的一个重要现象,这个过

程主要发生在细胞受刺激剂激活的最初几十秒到几分钟内。T细胞活化的经典途径是磷脂酰肌醇( PIP2 )代谢。磷脂酰肌醇代谢产物1, 4, 5-三磷酸肌醇( IP3)可通过与内织网上膜受体结合而促使内织网内贮存Ca2+ 释放,提高胞内

Ca2+ 的水平,而胞内Ca2+ 浓度的升高可促进N F-AT( nucleic facto r of actived T cell )的生成,后者具有促进IL-2基因表达的作用。实验结果表明,较高浓度( 100μg /ml)的CDPS在作用5、10 min时对小鼠胸腺细胞内Ca2+ 浓度有明显的促进升高作用,且与Co nA具有协同作用。故我们推测, CDPS促进小鼠胸腺淋巴细胞内钙释放, 使胞内钙离子浓度升高而促进了IL-2基因的表达,导致T细胞增殖,正是肉苁蓉多糖对机体调节作用的理论依据之一。

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