2.2 愈伤组织继代培养

2.2.1 愈伤组织继代培养基和培养条件：外植体上诱导出的愈伤组织生长25d左右开始变褐，20d时将愈伤组织及时切下进行继代培养，以后每25d继代1次。继代的基本培养基为B5，在暗培养条件下生长缓慢，在半光照（10h／d）条件下生长速度明显加快。采用正交实验方法L（3），对外植体、植物生长调节物质和蔗糖浓度在半光照（10h／d）培养条件下的生长情况进行了筛选，愈伤组织生长量为生长52d时的结果，见表7。在半光照（10h／d）条件下，对愈伤组织生长影响较大的培养条件是蔗糖浓度，其次是激素6-BA和NAA，而采用愈伤组织0～2代材料培养对愈伤组织生长的影响不是主要因素。方差分析结果（表8）表明这几种因素对愈伤组织的生长量影响差异均无显著性。

表7 植物激素与培养条件正交设计表及结果

Table 7 Orthogonal design and results of plant

hormones and culture conditions

2.2.2 愈伤组织生长与褐化：愈伤组织在培养初期生长缓慢，在0～10d属于生长延迟期，生长速度接近于0，此阶段后期生长略有加快，在15～25d内，生长速度明显加快，生长量增加显著，是延迟期的6.3倍，25～30d生长最快，生长速度是延迟期的

表8 愈伤组织生长量方差分析表

Table 8 Variance analysis of callus growth

Fo.s=19.00 F#99.01

14.5倍，愈伤组织的最佳继代时间是25～30d．45d后愈伤组织生长量下降到与延迟期相当的水平，且开始褐化，50d后褐化加重，彻底停止生长。愈伤组织生长曲线见图1。

图1 肉苁蓉愈伤组织生长曲线

Fig 1 Time curve of callus growth of C deserticola

2.3 愈伤组织物质中有效成分的测定：将在B5培养基中继代培养40d左右的愈伤组织取出并自然干燥后，应用《中国药典》2005年版一部方法对愈伤组织中毛蕊花糖苷和松果菊苷进行测定，结果见图2．经换算肉苁蓉愈伤组织培养物中松果菊苷达3.92％，洋丁香苷（毛蕊花糖苷）可达0.45％；野生肉苁蓉肉质茎中松果菊苷达2.59％，毛蕊花糖苷1.40%。

图2 松果菊苷和洋丁香苷（毛蕊花糖苷）对照品（A）、肉苁蓉愈伤组织（B）、野生肉苁蓉（C）的HPLC图谱

3 讨论

对药用植物肉从蓉进行愈伤组织的诱导研究对扩大和保护自然资源具有重要的意义。肉苁蓉以其肉质茎入药，肉质茎的粗度通常在10cm左右，利用肉质茎中维管组织部分诱导肉苁蓉愈伤组织是最合适的外植体，在适宜的培养条件下可以诱导产生大伤组织。愈伤组织继代条件与诱导条件略有不同。

对于药用植物，特别是一些濒危药用植物，利用愈伤组织培养提取药用活性成分是一种行之有效的方法。郭志刚印等对盐生肉苁蓉愈伤组织培养方法与苯乙醇苷化合物合成进行了研究，认为愈伤组织中的主要成分与天然肉苁蓉基本相同。于荣敏等对银杏愈伤组织培养和其代谢产物银杏内酯进行了研究，筛选出了银杏内酯高产细胞系，银杏内酯量达万分之一，与天然植物的量相当。

笔者利用高效液相色谱技术对野生肉苁蓉肉质茎和由肉质茎诱导出的愈伤组织物质中主要药用活性成分麦角甾苷的测定比较，证明了愈伤组织培养物质中含有较高质量浓度的毛蕊花糖苷。《中国药典》2005年版一部中对肉苁蓉药材质量标准的要求中明确指出，样品干样中松果菊苷（C＝HO）和毛蕊花糖苷（C～H＝O）的量应不低于0.3％。测定的愈伤组织干物质中松果菊苷（C＝H＝O＝）和毛蕊花糖苷（C-HOs）的量为4.37％，野生肉苁蓉肉质茎为3.99％。充分说明利用肉苁蓉愈伤组织培养技术来提取药用有效成分是可行的，可以减少对自然资源的采挖压力。