（1．新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室，新疆乌鲁木齐 830011；

2．新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004）

摘要：目的 探讨肉苁蓉乙醇提取物肉苁蓉苯乙醇样糖苷（CPhG）对大鼠免疫性肝纤维化的作用及其作用机制。方法SD大鼠75只，随机分为正常对照组、模型组、复方鳖甲软肝片（0.6g·kg＇）阳性药对照组、CPhG 0.125,0.25和0.5g·kg＇组，CPhG组每组13只，其他每组12只，皮下和尾静脉注射牛血清白蛋白诱导大鼠肝纤维化模型，造模同时ig给予相应药物，每日1次，共15周。测定大鼠肝指数，Masson染色法观察肝组织纤维化，全自动化分析仪测定血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量变化，羟脯氨酸（HyP）测定试剂盒测定肝匀浆中HyP含量的变化；免疫组化法观察肝组织中｜型和川型胶原蛋白表达的变化。结果 与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数显著升高（P＜0.05）。模型组大鼠肝组织胶原纤维延伸连接，包绕整个肝小叶使正常肝小叶结构破坏，大方型假小叶形成；模型组大鼠血清中GPT，GOT，ALP．TP和ALB含量及肝匀浆中HyP含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），1型和川型胶原蛋白的表达均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，CPhG 0.125,0.25和0.5g·kg＇能降低肝纤维化大鼠肝指数（P＜0.05），肝组织形态与正常对照组接近，血清中GPT，GOT，ALP，TP和ALB含量及肝匀浆中HyP含量降低（P＜0.05，P＜0.01），且能抑制肝组织中I型和目型胶原蛋白的表达（P＜0.05，P＜0.01）。结论 CPhG能降低免疫性大鼠肝纤维化程度，其机制可能与降低I型和川型胶原蛋白表达进而抑制肝星状细胞活化、减少胶原生成有关。

关键词：肉苁蓉；苯乙醇样糖苷；肝纤维化；胶原蛋白

中图分类号：R285.5    文献标志码：A    文章编号：1000-3002-（2016）05-0504-07

DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.004

肉苁蓉属（Cistanche）植物是著名的名贵补益类中药。因其疗效确切，药性温和，所以自古就被视为强壮、滋补的中药，有“沙漠人参”之美誉。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们的关注。化学及药理学研究显示，肉苁蓉肉苁蓉苯乙醇样糖苷（Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhG） 是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一。CPhG具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性。Peter于1989年首次发现CPhG类化合物松果菊苷具有显著的保肝护肝作用，随后引起人们对CPhG进行抗肝纤维化研究的兴趣。本课题组的前期研究已经发现，肉苁蓉的肉质茎部提取物类叶升麻苷和异类叶升麻苷，对于体外免疫性肝损伤均有较好的肝保护作用和抗乙肝病毒作用，但对于CPhG抑制肝纤维化的进程及抗肝纤维化的具体机制还未明确。本研究对大鼠皮下和尾静脉注射牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）制备免疫性肝纤维化模型，评价肝损伤及纤维化的程度，以探讨CPhG保肝、抗肝纤维化的作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

德赢vwin登录 （C．tabulosa）新鲜肉质茎6.0kg，70％乙醇热回流提取3次，每次3h，合并提取液。AB-8树脂纯化得到苯乙醇样糖苷提取物即CPhG类化合物，经新疆维吾尔自治区药物研究所赵军研究员用高效液相色谱法鉴定为CPhG，纯度为70％。用0.5％羧甲纤维素钠（CMC-Na）将药物配制成不同浓度，置4℃冰箱保存待用。复方鳖甲软肝片（compound Biejia-rangan tablets，BJRG）

（内蒙古福瑞科技股份有限公司，批号：20131006），BSA（美国Sigma公司产品，CAS：9048-46-8，原装进口），羊毛脂（上海源叶生物科技公司），液体石蜡（天津市富宇精细化工有限公司），磷酸盐缓冲液［飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号：NZD1132］。肝组织羟铺氨酸（hydroxyproline，HyP）检测试剂（南京建成生物工程研究所，批号：20140526），兔抗｜型胶原抗体0.2mL（美国Abcain公司，批号：140619），免抗型胶原抗体0.2mL（中国Bioss公司，批号：980788W）。电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），L-530多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），全自动生化分析仪（迈瑞公司，系列号：A086A0182），化学发光分析仪（泰格科信，系列号：mp2808）。

1.2 动物、模型制备和给药

雄性健康SD大鼠，SPF级，体质量180-220g．由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（新）2011-0004。SPF环境实验动物使用许可证号：SYXK（新）2011-0004，饲养受控环境条件（25℃和12h光／暗周期），大鼠自由进食与饮水，喂标准颗粒饲料，常规饲养3d后使用。动物实验的所有相关程序由新疆医科大学第一临床附属医院动物伦理委员会批准。

75只SD大鼠随机分为6组，即正常对照组、模型组、BJRG阳性药对照组（0.6g·kg＇）、CPhG0.125.0.25和0.5g·kg＇组，CPhG组每组13只，其 他每组12只。参照药品说明书，进行人和大鼠间体表面积折算的等效剂量比值设定BJRG阳性药对照组剂量，CPhG剂量参照文献［8］及预实验结果设置。除正常对照组外，大鼠采用朱启贵等方法制备免疫性肝纤维化模型，造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段：除正常对照组每只注射0.5mL生理盐水以外，其余各组大鼠均多点sc给予含BSA9g·L-＇弗氏不完全佐剂，每次0.5mL，共5次。前2次注射间隔为14d，后3次注射间隔为7d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼内呲静脉丛采血，采用双向扩散法检测大鼠血清抗BSA抗体。攻击阶段：抗体阳性大鼠作为模型组及给药组，继续尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2mL逐渐递增至每只4mL；正常对照组尾静脉注射生理盐水。给药：造模同时按设定剂量ig给药（空白对照组和模型组ig给予蒸馏水）每日1次；造模结束后继续治疗4周，每日1次，实验周期共计15周。

1.3 肝指数测定

各组于末次ig后禁食（不禁水）24h，称重，颈椎脱白处死，取肝，用滤纸吸干脏器表面血液，剪去脂肪和系膜后称重，计算肝指数。肝指数＝器官质量（g）／体质量（g）x100。

1.4 Masson染色观察肝组织纤维化

所有大鼠取同一部位肝组织，用10％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片并Masson染色，显微镜下观察组织学变化。肝纤维化分级参照文献［10］分为5级。0级：无纤维化；1级：纤维结缔组织仅限于汇管区或汇管区有扩大，有向小叶发展的倾向；l级：纤维结缔组织增生，超过小叶的2／3并伴有1级改变：级：纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围；V级：纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有级改变。

1.5 血清生化指标的检测

各组大鼠于末次给药后禁食（不禁水）24h，称重，经戊巴比妥钠（30mg·kg＇，ip）麻醉后取血，12000xg离心10min分离血清，采用全自动生化仪检测血清谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transterase， GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transterase， GOT）、碱性磷酸酶（akaline phosphatase，ALP）、总蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，ALB）含量。

1.6 肝组织匀浆中羟脯氨酸含量的测定

精确称取肝组织0.1g（湿重）放入试管中，准确加水解液1mL，混匀。严格按照肝组织HyP检测试剂盒说明书操作测定肝组织HyP的含量。

1.7 免疫组化法测定肝组织纤维化｜型和型胶原蛋白表达

组织切片用Nkon DIGITAL SIGHTDS-F2型生 物显微镜进行观察，并用K12320型显微摄像系统在低倍镜、高倍镜下选取清晰视野拍照。采用MoticMed 6.0 CMIAS彩色图像分析软件，通过显微摄像系统放大200倍，每片随机选取3个视野，每个视野随机选取5个2cmx3cm大小的区域，1型和目型胶原蛋白免疫组化阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒状染色，测定其平均吸光度值，值越大表明组织中｜型和型胶原蛋白含量越高。计算公式：吸光度值＝胶原面积（c㎡）／肝组织面积（c㎡）。

1.8 统计学分析

用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，实验结果数据采用xts表示；多组间均数比较采用方差分析one-way ANOVA，多组样本均数两两比较采