摘要: 目的研究肉苁蓉多糖( CDPS) 对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠在突触可塑性方面的改善作用。方法昆明小鼠随机分为6 组，分别为东莨菪碱模型组、正常对照组、CDPS 小剂量( 25 mg·kg － 1 ) 组、CDPS 中剂量( 50 mg·kg － 1 )组、CDPS 大剂量( 100 mg·kg － 1 ) 组和阳性对照组。除正常对照组外，其他组小鼠口服给CDPS 6 周，并于Morris 水迷宫训练第4 天前腹腔注射东莨菪碱4mg·kg － 1， 30 min 后进行行为学指标测定，包括Morris 水迷宫和跳台试验。处死取脑海马组织，运用Western blot 技术及ＲT-PCＲ 比较小鼠海马区GAP-43，SYP 以及PSD-95 的蛋白水平及基因水平的表达差异，并用透射电镜观察海马CA3 区突触数量与相关结构的变化。结果CDPS ( 25、50、100 mg·kg － 1 ) 组小鼠与正常对照组小鼠在水迷宫实验的潜伏期明显短于模型组小鼠，而且在Q3 象限的时间明显大于模型组小鼠。CDPS( 50、100mg·kg － 1 ) 组小鼠跳台实验中的错误次数与模型组小鼠相比减少。Western blot 与ＲT-PCＲ 实验结果显示，模型组小鼠海马区GAP-43、SYP 的表达水平与正常对照组比较明显降低。CDPS ( 25、50、100 mg·kg － 1 ) 组小鼠海马区SYP 的表达较模型组明显增高，CDPS ( 25、50 mg·kg － 1 ) 组小鼠海马区GAP-43 的表达水平较模型组明显增高，PSD-95 的表达在不同组中没有明显变化。最后，我们观察小鼠海马CA3 区的超薄切片发现，CDPS 可以使CA3 区突触数量增多。结论

东莨菪碱可以造成小鼠学习记忆障碍模型，并使小鼠海马区相关蛋白表达异常，由此引起突触可塑性的变化，进而导致学习记忆能力的改变。而CDPS 能够提高SYP 与GAP-43的表达，增多突触数量，使突触可塑性有所恢复，并且改善小鼠的学习记忆能力。

关键词: 肉苁蓉多糖; 突触可塑性; 学习记忆; SYP; GAP-43; PSD-95

肉苁蓉始载于《神农本草经》并列为上品，为列当科植物肉苁蓉( Cistanche deserticola Y． C． Ma) 的带鳞叶的肉质茎，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，在历代补肾阳处方中使用频度最高［1］。中医认为: 脑为髓海，精生髓，肾藏精，在下为肾，在上为脑，虚则皆虚［2］。所以我们认为有益肾作用的肉苁蓉也应具有改善学习记忆的功效。但是迄今为止，未见关于肉苁蓉改善学习记忆的报道。

现在学习记忆的研究得到了广泛的重视，根据已有研究经生物信息学分析，已经确定了和学习记忆训练相关的脑区域及相关蛋白［3 － 5］。但是从神经可塑性角度阐述益智药物作用机制的鲜有报道。因此我们采用东莨菪碱诱导的学习记忆障碍小鼠为模型，并用肉苁蓉多糖( CDPS) 对模型小鼠进行治疗。观察药物对小鼠行为学表现的影响，对小鼠海马区的突触素( synaptophysin，SYP) 、生长相关蛋白43( growth associated protein 43，GAP-43) 、突触后致密蛋白95 ( postsynaptic density protein-95，PSD-95 ) 3个突触可塑性相关蛋白表达的影响，以及对突触数量及形态的影响，从而系统了解CDPS 对东莨菪碱所致的学习记忆障碍模型小鼠的药效，并探讨其干

预作用的靶点及机制，为进一步研发新药提供实验依据。

1 材料与方法

1． 1 实验材料

1． 1． 2 实验动物昆明小鼠，♂♀各半，体质量( 25 ± 2) g，购自内蒙古大学动物中心，批准号: 2000－ 017 号

1． 1． 3 药品与试剂肉苁蓉多糖由本实验室自行提取［6］，多糖纯度为88%。其他试剂有氢溴酸东莨菪碱( Sigma，USA) ，PSD-95 抗体( 1 ∶ 2 000; Abcam，UK) ，GAP-43 抗体( 1 ∶ 1 000; 1 ∶ 500; C-20，Santa

Cruz Biotechnology，USA) ，SYP 抗体( 1 ∶ 1 000;1 ∶ 500; C-20，Santa Cruz Biotechnology，USA) ，TotalＲNA Kit ( Tiangen，China) ，ＲevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit( Thermo Scientific，USA) 。

1． 2 试验方法

1． 2． 1 模型制备于行为学实验第4 天前30 min，除正常对照组腹腔注射等量的生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射东莨菪碱( 4 mg·kg － 1 ) 。

1． 2． 2 实验分组采用分层随机法随机将动物分为6 组。①蒸馏水组( 正常对照组) ; ②东莨菪碱组( 模型组) 4 mg·kg － 1 ; ③多奈哌齐组( 阳性对照组)0. 8 mg·kg － 1 ; ④CDPS 不同剂量组: 25、50、100 mg·kg － 1。每组各12 只，♀♂各半。除正常对照组外，其他组小鼠口服给肉苁蓉多糖6 周后，于行为学训练第4 天前腹腔注射东莨菪碱( 4 mg·kg － 1 ) 。

1． 2． 3 行为学实验Morris 水迷宫测试［7］ Morris水迷宫由一个圆形水池和自动录像及分析系统两部分组成。水池高70 cm，直径100 cm，有机玻璃站台放置其中一个象限中央，水温控制在( 22 ± 2℃) 。6组动物每天训练2 次，共训练5 d，于d 4 训练前30min 造模。数据采集、处理由图像自动监视和处理系统完成，得到游出时间( 即入池到找到站台的时间) 和动物在第三象限时间，以及搜索站台的全过程录像。小鼠被动回避性跳台实验［8］装置为80 cm × 16cm × 40 cm 的茶色有机玻璃箱，箱底铺有铜栅作为刺激电极，内设高4. 5 cm，直径6. 5 cm 的橡皮垫作为回避电击的安全平台。先放入小鼠适应5 min，以36V 交流电电击小鼠，若小鼠跳上安全平台为正确，如从台上跳下，双足接触铜栅为错误反应。记录3min 内出现的错误反应数。24 h 后重测验，以小鼠学习和次日重测验( 记忆) 过程中出现的错误反应次数及潜伏时间来评价学习记忆能力。

1． 2． 4 Western blot 水迷宫检测后，立即将小鼠断头处死，头置冰盘中快速分离双侧海马，用生理盐水冲洗表面血迹，以1 ∶ 9 ( 即100 mg 重量加入900 μl体积) 的比例加入蛋白匀浆提取液，加入适当体积的上样缓冲液，终浓度为5 g·L － 1，煮沸5 min，分装。用10%聚丙烯酰胺分离胶，4% 聚丙烯酰胺浓缩胶进行电泳，将蛋白质从SDS-PAGE 凝胶转移至PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉封闭，上一抗SYP 或者GAP-43，4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，显影。

1． 2． 5 ＲT-PCＲ 依据文献方法［9］进行试验。用试剂盒( Tiangen，China) 提取总ＲNA，用ＲevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit ( Thermo Scientific，USA) 进行逆转录，最后对cDNA 样品进行扩增。采用Primer 5． 0 软件进行引物设计，设计得到引物如下: SYP upstream( 5'-CTT CGG CGA CTT CTA CTACTT T-3') ，downstream( 5'-GGA GCG GAT GGA TGTTTG-3') ; GAP-43 upstream( 5'-TGA GCC TGT CCTCTC CTA CCT A-3') ，downstream( 5'-GCC ATA ACAACA CCA AGA AAC A-3') ; GAPDH upstream( 5'-CAT CTA GGA GGG CTA TGC TC-3') ，downstream( 5'-ATG TCA CGC ACG ATT TCC-3') 。

1． 2． 6 透射电镜按透射电镜常规制样方法处理组织块，EPON812 包埋，LKB 超薄切片机切片，柠檬酸铅和醋酸铀双染色，H7650 透射电镜下观察切片。在电镜下选择Gray-I 型兴奋突触拍片，每个样品随机选取4 ～ 6 张电镜照片。突触活性带长度的测定按罗兰等( 1990) 的方法进行。突触间隙采用多值平均法，突触数密度( PSD) 与穿孔突触比例统计: 突触计数依据JONES 等( 1991) 所确定的标准。

1． 2． 7 统计学处理采用SPSS9． 0 统计软件包，结果用珋x ± s 表示。两组及多组样本均数比较进行单因素方差分析。方差齐时，两两比较采用T 检验法; 方差不齐时，两两比较采用卡方检验法。

2 结果

2． 1 CDPS 对小鼠行为学表现的影响在用Morris水迷宫测试小鼠空间学习记忆能力试验中，模型组小鼠的游泳时间和游泳距离比正常对照组明显延长( P ＜ 0. 05) ，说明模型小鼠已经出现学习记忆障碍。而与模型组相比，CDPS 能明显缩短模型小鼠的游泳时间( P ＜ 0. 05，Fig 1A) ，明显增长鼠在Q3象限的时间( P ＜ 0. 05，Fig 1B，1 C) ，特别是小剂量组和中剂量组能明显改善小鼠的学习记忆能力( P＜ 0. 01) 。为了保证行为学实验的参考性，我们又对实验动物进行了跳台实验。结果显示，模型组与正常对照组相比，错误次数和潜伏时间上差异具有显著性( P ＜ 0. 01) ，与模型组相比，CDPS 能够减少小鼠的错误次数，延长潜伏时间( P ＜ 0. 05) 。与Morris 水

迷宫的结果相一致，仍然是小剂量和中剂量有更明显( P ＜ 0. 01) 的改善学习记忆的作用( Tab 1) 。

2． 2 CDPS 对东莨菪碱所致的学习记忆障碍模型小鼠的GAP-43，SYP 和PSD-95 表达水平的影响为了进一步探讨行为学结果与相关蛋白表达的相关性，我们取小鼠脑海马组织进行匀浆，运用Westernblot 检测SYP、GAP-43 与PSD-95 表达水平的变化。结果显示: 与模型组相比，给药组的SYP 及GAP-43 的条带明显增粗，颜色加深( Fig 2) ，提示两种蛋白的表达水平明显提高，特别是小剂量和中剂量组。但是各用药组PSD-95 的蛋白表达水平与模

型组相比差异无显著性。为了巩固蛋白表达水平的检测结果，保证GAP-

43 和SYP 表达水平差异有显著性结果的确定性，我们进一步检验了mＲNA 水平上两个蛋白的表达。用小鼠海马组织匀浆，经ＲT-PCＲ 检测SYP 及GAP43 的mＲNA 表达水平。结果显示: 与模型组相比，给药组的SYP 的条带明显增粗，颜色明亮，特别是小剂量组与中剂量组，而GAP-43 的条带也明显增粗，特别是小剂量和中剂量组( Fig 3，Tab 2) 。提示，GAP-43 与SYP 在mＲNA 水平上，用药组与模型组比较差异有显著性。

2． 3 CDPS 对小鼠CA3 区的突触数量及相关形态的影响为了在超微水平探讨CDPS 对于突触可塑性的影响，我们运用透射电镜技术观察突触数量和突触厚致密部( PSD) 的变化。如Fig 4 ～ 5 所示，在相同视野下，CDPS 组小鼠海马CA3 区突触数密度增大。用药组与正常对照组和模型组比较，突触数量明显增多( P ＜ 0. 05) ，而突触间隙、PSD 厚度没有差异，提示CDPS 能够影响海马CA3 区突触数目，但不影响PSD 的相关形态特征。

3 讨论

Purro 等［10］研究发现，认知功能障碍的早期表现主要包括突触的丢失和突触功能的异常。若能提高突触的可塑性，修复这种丢失及功能异常，则可以有效地改善认知功能障碍。但是，目前仍然缺少有效的治疗药物，能够促进可塑性事件的发生。SYP位于神经末梢突触囊泡内的钙结合蛋白，与突触结构和功能关系密切，其表达水平可有效地反映突触的状态，是神经损伤后突触发生的重要标志之

一［11 － 12］。突触发生丢失、数量减少时或者功能异常时，SYP 的含量降低导致突触传递障碍，从而引起记忆和认知功能下降。GAP-43 是位于轴突生长锥质膜上的磷酸蛋白，在正常成熟的神经元上低表达，在神经发育和再生过程中呈高表达，被作为突触生长的标志物，国际上将其列为神经可塑性的首选分子探针［13 － 14］。PSD-95 是膜结合鸟氨酸蛋白激酶超家族中的一员，是突触后致密区( PSD) 的一种主要蛋白。PSD-95 参与调节离子通道的功能、突触活性和细胞内信号转导，是一种重要的神经细胞骨架蛋白。它能够使谷氨酸NMDA 受体簇集在突触活性区，从而保证突触信号传递的有效进行［15 － 17］。我们通过Morris 水迷宫及跳台试验发现，CDPS组小鼠空间任务的成绩明显优于模型组的小鼠，说明CDPS 可以明显改善东莨菪碱诱导模型小鼠的空间学习能力及记忆水平。我们随之进行Westernblot 对各实验组小鼠海马中SYP、GAP-43 及PSD-95表达水平进行考察。结果发现，与模型组相比，CDPS 对PSD-95 的表达没有明显改变，但是CDPS给药组的SYP 与GAP-43 蛋白的表达水平明显增高，尤其是小剂量和中剂量组。而这两组的行为学表现也明显优于模型组。针对这种积极的相关性，

我们进一步在mＲNA 水平检测SYP、GAP-43 的表达，ＲT-PCＲ 实验结果与此基本一致，证实了CDPS增高SYP 及GAP-43 表达水平这一事实。最后我们考察了CDPS在超微水平对突触的影

响。我们采用透射电镜技术观察突触数量及突触相关结构的变化。实验结果显示，用药组突触的数量明显增多，但是突触PSD 部分的形态没有改变，这提示我们，CDPS 的作用机制主要是影响突触的数量。

综上所述，CDPS 能够改善东莨菪碱所致的学习记忆障碍，提高小鼠的学习记忆能力。其作用机制是通过提高突触可塑性相关蛋白的表达水平，促进突触的形成，增加突触的数量，增强了突触的可塑性，从而改善东莨菪碱造成的损伤。

参考文献:

［1］ Wu X M，Tu P F． Studies on the chemical structure of polysaccharideCDP-4 isolated from Cistanche deserticola［J］． J Peking Univ( Health Sclences) ，2004，36( 1) : 24 － 6．

［2］ 何梦瑶，吴国昌． 医编［M］． 北京: 中国中医药出版社，2009:12．

［2］ He M Y，Wu G C． Yi Bian［M］． Beijing: China Press of TraditionalChinese Medicine，2009: 12．

［3］ Deiana S，Platt B，Ｒiedel G，The cholinergic system and spatiallearning［J］． Behav Brain Ｒes，2011，221( 2) : 389 － 411．

［4］ Kaplan M P，Abel T． Genetic approaches to the study of synapticplasticity and memory storage［J］． CNS Spectr，2003，8 ( 8) : 597－ 610．

［5］ Fadda F，Cocco S，Stancampiano Ｒ． Hippocampal acetylcholinerelease correlates with spatial learning performance in freely movingrats［J］． Neuroreport，2000，7( 10) : 2265 － 9．

［6］ 吴波，黄敏，马迎军． 肉苁蓉水溶性多糖的分离纯化及分析［J］． 广州医学院报，2006， 34( 1) : 58 － 60．

［6］ Wu B，Huang M，Ma Y J． Isolation，purification and analysis ofpolysaccharide of Cistanche deserticola［J］． Acad J GuangzhouMed Coll，2006，34( 1) : 58 － 60．

［7］ Morris Ｒ． Development of a water maze procedure for studying spatiallearning in the rat［J］． Neurosci Methods， 1984， 11( 5) : 47 － 60．

［8］ 赵晓民，谢湘林，鲁澄宇，等． 人参茎叶皂苷和胆碱合用对喹啉酸损毁基底核大鼠学习记忆的影响［J］． 中国药理学与毒理学杂志，2000， 14( 6) : 417 － 20．

［9］ Zhong Z，Wu D，Lü L， et al． Effect of Panax notoginseng saponinson the expression of beta-amyloid protein in the cortex of the parietallobe and hippocampus，and spatial learning and memory in amouse modeI of senile dementia［J］． Neural Ｒegen Ｒes，2008，3( 12) : 1297 － 303．

［10］ Purro S A，Dickins E M，Salinas P C． The secreted Wnt antagonistDickkopf-1 is required for amyloid-mediated synaptic loss．［J］． J Neuroscience，2012，32( 10) : 3492 － 8．

［11］ 万摇东，祝慧凤，罗摇勇，等． 梓醇对大鼠梗死灶周围大脑皮质神经元树突生长及突触素表达的影响［J］． 中国药理学通报，2012，28( 11) : 1515 － 20．

［12］ Ujike H，Takaki M，Kodama M，et al． Gene expression related tosynaptogenesis，neuritogenesisand MAP kinasein behavioralsensitizationto psvchostjmulants．［J］． Ann NY Acad Sci， 2002， 965( 6) :55 － 67．

［13］ 王晓英，张均田． 突触可塑性与相关蛋白研究进展［J］． 中国药理学通报，2001，17( 4) : 369 － 72．

［14］ 刘志婷，俞天虹，曲铁兵，等． 补阳还五汤对小鼠局灶性脑缺血后生长相关蛋白43 和突触素表达的影响［J］． 中华行为学与脑科学杂，2012，21( 12) : 1070 － 2．

［15］ Xu W，Schlutcr O M，S1einer P，et al． Molecular dissociation ofthe role of PSD-95 in regulating synapticstrength and LTD［J］．Neuron，2008， 57( 2) : 248 － 62．

［16］ Jourdi H，lwakura Y，Narisawa-Saito M，et al． Brain-derived neurotrophicfactor signal enhances and maintains the expression ofAMPA receptor-associated PDZ proteins in developing cortical neurons．［J］． Dev Biol，2003，263( 2) : 216 － 30．

［17］ Ehrlich I，Malinow Ｒ． Postsynaptic density 95 controls AMPA receptorincorporation during long-term potentiation and experiencedrivensynaptic plasticity［J］． J Neurosci，2004，24( 4) : 916 － 27．