摘要: 试验观察了肉苁蓉多糖对肉鸡免疫新城疫苗后T 淋巴细胞活性及IFN- γ含量的影响。结果: 肉苁蓉多糖使用剂量5、10、20mg/只时, 免疫后15 d 时, T 淋巴细胞转化率分别为1.20±0.11、1.30±0.13、1.79±0.32, 对照组为1.22±0.29; 免疫后20 d 时, 外周血中IFN- γ含量分别为23.23±6.13、25.95±1.13、29.95±2.23 pg/ml, 对照组为20.89±5.97 pg/mL; 肉苁蓉多糖使用剂量10、20mg/只时, 试验组T 淋巴细胞活性及IFN- γ含量显著或极显著高于对照组( ( P<0.05 或0.01) 。表明肉苁蓉多糖可能通过提高T 细胞活性及IFN- γ含量来增强肉鸡免疫功能。

关键词: 肉苁蓉多糖; 新城疫; T 淋巴细胞; γ- 干扰素

1 前言

肉苁蓉(Cistanche DeserticolaY C Ma) 别名大芸, 主要分布于新疆、内蒙等地, 药用部分为带鳞片的肉质茎, 具有强肝补肾、益精血、润肠等功效。药理学研究表明, 肉苁蓉具有提高机体免疫功能、促进DNA 合成、抗衰老及雄激素样等重要作用, 其主要生物活性成分包括肉苁蓉多糖、黄酮、3D- 甘露醇、琥珀酸、甜菜碱、咖啡酸糖酯等。肉苁蓉糖是调节机体免疫功能的主要活性成分, 研究表明, CDPS 能单独和协同ConA、PHA 促进小鼠胸腺淋巴细胞增殖, 增强小鼠脾淋巴细胞分泌IL- 2 的能力,提高小鼠脾指数、血清溶血素值及E- 玫瑰花结形成率, 促进小鼠腹腔内吞噬细胞的吞噬能力。目前, 肉苁蓉多糖在兽医临床中的应用及研究较少, 本课题组将肉苁蓉多糖作为一种免疫增强剂配合鸡新城疫苗免疫肉鸡, 结果发现其能提高免疫肉鸡血凝抗体效价及血清对ND 病毒的中和指数。为探讨肉苁蓉多糖促进肉鸡免疫机能的可能机制, 本试验初次观察了肉苁蓉多糖对鸡免疫新城疫苗后血液中T 淋巴细胞活性及血清中IFN- γ含量的影响, 以期为CDPS 作为一种新的免疫增强剂提供一定的理论依据, 现将试验结果报道如下。

2 材料与方法

2.1 主要试剂及药品ND LaSota 弱毒疫苗: 哈尔滨维科生物技术开发公司, 200732。刀豆素球蛋白(ConA) : Sigma公司产品, 64H7095。四甲基偶氮唑蓝(MTT): 华美生物工程公司产品, BS0887。淋巴细胞分离液: 南京建成生物工程研究所产品,20060507。小牛血清: 杭州四季青生物工程有限公司产品, 051215。改良型RPMI1640 培养基:海克隆生物化学制品( 北京) 有限公司, NSA0028。IFN- γELISA 试剂盒: 美国IDEXX 产品, 主要包括IFN- γ一抗包被的酶标板, IFN- γ标准品, 生物素标记的IFN- γ二抗,浓缩酶联物(HRP) , 批号:064218。肉苁蓉多糖: 西南大学荣昌校区生理生化研究室制备, 肉苁蓉多糖含量≥76%。

2.2 试验动物20 日龄健康罗曼肉公鸡60 只, 购自荣昌一养收稿日期: 2008- 06- 09 鸡场。

2.3 试验方法

2.3.1 动物分组将20 日龄罗曼肉公鸡随机分为4 组, 每组15 只, 即肉苁蓉多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、生理盐水对照组( IV) , 常规隔离饲养, 饮水中添加适量抗生素、地克朱利、葡萄糖、电解多维, 预防细菌性疾病和寄生虫病。

2.3.2 新城疫苗免疫方法试验鸡每隔4 d, 随机抽取8 只采血, 监测鸡新城疫血凝抑制(HI)抗体效价, 当母源抗体效价低于3log2 时进行ND 疫苗免疫, 各组鸡肌肉注射2 倍剂量的ND LaSota 苗, 同时, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别肌肉注射50 mg/mL 肉苁蓉多糖100、200、400 μL/只、IV 组肌肉注射灭菌生理盐水400μL/只。

2.3.3 外周血清中IFN- γ含量的测定

2.3.3.1 鸡血清的收集及保存免疫后20d, 每组随机取8 羽翅静脉采血2～3mL, 39 ℃静置30min后再4 ℃静置1 h, 3 000 r/min, 离心10 min, 收集血清, - 20 ℃保存, 以测定外周血清中IFN- γ含量的变化。

2.3.3.2 IFN- γ含量测定采用ELISA 方法进行。试剂盒整体平衡至20℃后取出包被有单抗的酶标板→配置标准品、洗涤液、辣根过氧化物酶标记物(HRP) 、生物素化的二抗(Biotin) →反应板每孔加入100 μL 标准品、备检血清→混匀30s, 37℃温育60min→洗板→加入100 μL Biotin→混匀30 s, 37 ℃温育60 min → 洗板→每孔加入100 μL HRP→轻轻混匀30 s, 37 ℃温育30 min→洗板→每孔加入100 μL TMB 显色液→轻轻混匀10 s, 37 ℃暗处温育30 min→每孔加入100 μL终止液, 轻轻混匀30 s, 30min 内在450nm处读OD 值。以标准品OD 值为纵坐标, 以标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 根据待测血清样品OD 值和标准曲线,由Bio- Rad Laboratories 软件自动计算样品中IFN- γ的含量。

2.3.4 T 淋巴细胞转化活力测定: 采用MTT 法进行。

2.3.4.1 5 mg/mL MTT 显色剂的配制: 称取MTT0.088 5 g, 溶于17.7mL pH7.2 的PB 中。

2.3.4.2 10%SDS- 0.01mol/L HCl:称取SDS10.00 g, 溶于100 mL0.01mol/L 的HCl。

2.3.4.3 含ConA 的RPMI1640 完全营养液: 量取RPMI1640 18mL,加入小牛血清2 mL, 混匀, 然后加入稀释好的青霉素和链霉素( 终浓度均为1 000 u/mL) ; 取上述营养液9.9mL, 加入用PBS 配制的1mg/mL 的ConA 0.1mL。

2.3.4.4 含ConA 的RPMI1640 完全营养液: 量取RPMI1640 18mL,加入小牛血清2 mL, 混匀, 然后加入稀释好的青霉素和链霉素( 终浓度均为1 000 u/mL) ; 取上述营养液9.9mL, 加入用PBS 配制的1mg/mL 的ConA 0.1mL。

2.3.4.5 孵育液取pH 7.6 的PB 89mL, 缓慢加入六偶氮副品红( 4%的亚硝酸钠溶液3mL, 慢慢滴入3 mL、40 mg/mL 的副品红溶液中, 边滴边搅拌) 6mL, 然后再加入α- 醋酸萘酯( α- 醋酸萘酯2g, 溶于100mL 丙酮) 5mL。

2.3.4.6 T 淋巴细胞转化活力测定免疫后15 d, 每组随机取8羽, 翅静脉无菌采集肝素抗凝血2mL, 再加入等量的RPMI1640完全营养液( 含10%小牛血清、双抗, 0.22 μm 除菌) 稀释, 在稀释好的血液上方小心加入等量淋巴细胞分离液, 1 500 r/min 水平离心15min, 用吸管吸出淋巴细胞层, 用RPMI1640 完全营养液洗涤淋巴细胞3 次, 以无血清RPMI1640 将淋巴细胞稀释成4×106 个/mL 的淋巴细胞悬液。将含ConA 的RPMI1640 完全营养液100 μL (ConA 终浓度10 μg/mL) 和单独的RPMI1640完全营养液100 μL 分别加入细胞培养板中, 各3 孔, 取淋巴细胞悬液加入上述6 孔细胞培养板中, 每孔100 μL, 将细胞培养板置于39.0 ℃、5%CO2、饱和湿度的CO2 培养箱中培养66h, 然后每孔加入5 mg/mL MTT 15 μL,继续培养4 h, 再加10% SDS-0.01mol/L HCl 100 μL/孔, 继续培养2h 后取出, 室温放置5min,用酶联免疫检测仪检测570 nm和630 nm 下的OD 值, 计算刺激指数( SI) 。用刺激指数判断T淋巴细胞转化的程度, 指数越大表明转化率越高。SI= 含ConA(OD570- OD630)不含ConA(OD570- OD630)

2.4 结果分析采用SPSS11.5数据分析软件对试验结果进行统计分析, 各指标用±S 表示, 同时进行t 检验。

3 试验结果

3.2 肉苁蓉多糖对肉鸡免疫ND 苗后外周血中T 淋巴细胞活性及IFN- γ含量的影响肉苁蓉多糖联合ND 苗免疫肉鸡后15 d 时, 淋巴细胞转化率以Ⅲ组最高, 与对照组比较呈显著差异P<0.05) , Ⅰ组、Ⅱ组与对照组比较差异不显著(P>0.05) ; 免疫后20d 时, 肉苁蓉多糖不同用量组外周血中IFN- γ含量均高于对照组, 但Ⅰ组与对照组比较差异不显著(P>0.05) , Ⅱ组、Ⅲ组与对照组比较差异显著或极显著(P<0.05 或0.01) 。结果见表1。

4 分析与讨论

试验结果显示, CDPS 对T淋巴细胞增殖活力具有一定的增强作用, 这与曾群力等报道肉苁蓉多糖单用时对小鼠脾、胸腺淋巴细胞增殖有明显促进作用,并可协同ConA、PHA 刺激小鼠胸腺细胞增殖的实验结果基本一致。T 淋巴细胞在免疫系统中起着极重要的作用, 一方面, 活化的B 细胞在Th 分泌的多种细胞因子作用下, 可增殖分化为分泌抗体的浆细胞和记忆B 细胞; 另一方面T 淋巴细胞可通过迟发型超敏性T 细胞和细胞毒性T 细胞介导特异性的细胞免

疫功能。表明CDPS 可能通过提高T 淋巴细胞的增殖活力以增强机体免疫功能。IFN- γ主要是由T 淋巴细胞不同的亚群分泌的免疫调节因子, 具有广泛抗病毒作用、抗肿瘤作用和双向免疫调节作用,同时对不同免疫细胞间相互作

用和发挥免疫功能具有重要的介导作用。IFN- γ能干扰病毒的繁殖, 其机制是IFN- γ与细胞表面相应受体结合后, 诱导细胞形成抗病毒蛋白, 从而抑制病毒复制。此外, IFN- γ还可通过增强或发动宿主对肿瘤细胞的免疫反应, 有利于促进单核巨噬细胞通过吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用杀伤肿瘤细胞。本次试验中CDPS 免疫组对IFN- γ诱生作用均高于生理盐水对照组, CDPS 用量分别为5、10、20 mg/只时, IFN- γ含量为23.23 ±6.13、25.95 ±1.13、29.95±2.23 pg/mL, 说明CDPS 对鸡IFN- γ含量的影响呈一定的量效关系, 这与杨铁虹等对当归多糖可诱生高水平的IFN- γ产生的结果基本一致, 表明CDPS可能通过提高血清中IFN- γ的含量, 进而诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等MHC- Ⅱ类抗原的表达, 促进其参与抗原的递呈及特异性的免疫识别过程,进而增强机体的免疫功能。

5 结论

结果表明, 肉苁蓉多糖能提高肉鸡免疫新城疫苗后外周血液中T 淋巴细胞的转化率及IFN- γ含量, 且其效果与肉苁蓉多糖用量存在着一定的量效关系。