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有研究表明肉苁蓉多糖具有增强免疫力、抗氧化等药理作用〔1〕。但其在线粒体水平上抗衰老作用的机制国内外未见报道。本研究通过观察衰老时线粒体抗氧化作用及能量代谢功能的变化探讨肉苁蓉多糖在线粒体水平的抗衰老作用。
1 材料与方法
1∙1 材料 普通级Ｗｉｓｔａｒ大鼠30只3～4月龄体重180～210ｇ雌雄各半由黑龙江省佳木斯大学实验动物中心提供合格证号：黑动字第99102001号。药材肉苁蓉由佳木斯药材公司提供经本校生药学教研室刘娟教授鉴定为肉苁蓉。
1∙2 仪器和试剂 岛津ＲＦ-5000型荧光分光光度计；赛多利斯ＰＰ-25型高灵敏度ｐＨ计；760ＣＲＴ双光束紫外可见分光光度计；ＧＬ-21Ｍ高速冷冻离心机。试剂：细胞色素Ｃ（氧化型）16-二苯基-135-己三烯（ＤＰＨ）由Ｓｉｇｍａ公司提供；ＨＥＰＥＳＮＡＤＨ去氧胆酸钠由ＡＭＲＥＳＣＯ公司提供；丙二醛（ＭＤＡ）试剂盒Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶试剂盒蛋白测定试剂盒：由南京建成生物工程研究所提供；Ｄ-半乳糖（Ｄ-ｇａｌ）由上海试剂二厂提供。
1∙3 方法
1∙3∙1 肉苁蓉多糖的提取〔2〕 取生药400ｇ用水浸泡30ｍｉｎ超声提取两次每次30ｍｉｎ抽滤器抽滤合并滤液将水提液加95％乙醇沉淀静置过夜次日抽滤分离沉淀将沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤干燥恒重后得肉苁蓉多糖4℃贮存。
1∙3∙2 动物分组、给药及处理 将30只大鼠随机分为3组：青年对照组、衰老模型组、模型给药组每组各10只常规饲料喂养。青年对照组每日上午皮下注射生理盐水同时灌服温开水；衰老模型组及模型给药组每日上午按50ｍｇ／ｋｇ剂量皮下注射Ｄ-ｇａｌ衰老模型组同时灌服温开水；模型给药组同时按生药2ｇ／ｋｇ灌服肉苁蓉多糖。连续给药6ｗ后处死动物取材。
1∙4 样本制备及指标测定 取肝脏1ｇ用冷生理盐水漂洗拭干称重加入9倍体积预冷的匀浆介质用电动匀浆机充分磨碎得肝组织匀浆将肝组织匀浆3000ｒ／ｍｉｎ离心10ｍｉｎ取上清冻存待测。按上述方法制备肝匀浆取10％肝组织匀浆2000ｒ／ｍｉｎ离心10ｍｉｎ弃沉淀取上清液在高速冷冻离心机中10000ｒ／ｍｉｎ离心15ｍｉｎ沉淀物即为线粒体将线粒体悬浮于介质中供指标测定。肝组织Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性肝线粒体
ＭＤＡ含量按试剂盒说明测定；肝线粒体磷脂酶Ａ2 （ＰＬＡ2）活性、膜流动性、呼吸链复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性测定参照文献方法进行〔34〕。
1∙5 统计学分析 采用ＳＰＳＳ11∙5软件数据均以ｘ±ｓ表示应用ｑ检验、方差分析。
2 结 果
2∙1 肉苁蓉多糖对大鼠肝组织Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性的影响 实验过程中衰老模型组及模型给药组各死亡1只大鼠。衰老模型组Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性〔（0∙711±0∙102） μｍｏｌＰｉ·ｍｇ－1·ｈ－1〕较青年组〔（1∙153±0∙203） μｍｏｌＰｉ·ｍｇ－1·ｈ－1〕显著下降（Ｐ＜0∙01）模型给药组〔（1∙023±0∙136） μｍｏｌＰｉ·ｍｇ－1·ｈ－1〕也降低但无统计学意义；肉苁蓉多糖可使肝脏Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性明显上升（Ｐ＜0∙01）并达到青年状态。
2∙2 肉苁蓉多糖对大鼠肝线粒体内ＭＤＡ含量、ＰＬＡ2 活性的影响 见表1。与青年组比较衰老模型组肝线粒体ＭＤＡ含量显著升高（Ｐ＜0∙01）肉苁蓉多糖使线粒体ＭＤＡ含量较衰老模型组显著降低（Ｐ＜0∙01）可恢复到青年水平。衰老模型组线粒体ＰＬＡ2活性较青年组显著提高给予肉苁蓉多糖线粒体ＰＬＡ2活性并未恢复到青年组水平（Ｐ＜0∙01）与衰老模型组比较肉苁蓉多糖可显著降低线粒体ＰＬＡ2活性（Ｐ＜0∙01）。
2∙3 肉苁蓉多糖对大鼠肝线粒体膜流动性的影响 见表1。衰老模型组荧光偏振度（Ｐ）较青年组显著升高（Ｐ＜0∙01）模型给药组Ｐ虽高于青年组但与青年组无显著差异；与衰老模型组比较模型给药组Ｐ明显降低（Ｐ＜0∙01）。
2∙4 肉苁蓉多糖对大鼠肝线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性的影响 见表1。与青年组比较衰老模型组呼吸链酶复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性显著下降（Ｐ＜0∙01）；与衰老模型组比较模型给药组明显提高复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活力（Ｐ＜0∙05Ｐ＜0∙01）模型给药组可将复合体Ⅰ ＋Ⅲ活性恢复到青年水平。
3 讨 论
目前被普遍接受的有关衰老的“自由基-线粒体损伤”假说认为线粒体是细胞内主要耗氧部位是产生自由基的主要场所也是自由基攻击的靶部位所以在线粒体水平上研究衰老及中药抗衰老的机制对揭示衰老本质有重要意义〔5～7〕。
有实验表明细胞膜钙泵活性随年龄增加而显著下降外排Ｃａ2＋的能力明显降低导致细胞内游离钙增加钙稳态失调〔8〕。钙超载时激活ＰＬＡ2ＰＬＡ2活性升高可改变膜磷脂的成分影响膜流动性损害呼吸链并造成线粒体不可逆损伤同时会产生大量自由基导致膜通透性增加钙离子大量流入进一步激活ＰＬＡ2〔9〕造成恶性循环。本研究表明肉苁蓉多糖可提高Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性降低肝线粒体ＭＤＡ含量、ＰＬＡ2 活性表明其可减轻自由基对肝组织及线粒体的损伤作用保证Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性使肝细胞内外钙离子浓度保持正常水平避免由于钙超载而导致线粒体ＰＬＡ2活性的升高。
适当的线粒体膜流动性对电子传递和质子转运以及氧化磷酸化的进行是必不可少的。本实验采用荧光偏振法以ＤＰＨ作为荧光探针标记线粒体膜来测定膜流动性荧光偏振度大膜流动性小；反之荧光偏振度小膜流动性大。肉苁蓉多糖可提高线粒体膜流动性这可能正是由于肉苁蓉多糖可以提高肝脏抗氧化能力减少氧自由基的生成减少脂质过氧化产物抑制ＰＬＡ2活性从而减少了导致线粒体膜流动性降低的各种因素使线粒体膜流动性保持正常保证了线粒体的功能。
线粒体产能过程中呼吸链上复合体的活性决定了产能的多少。复合体Ⅰ和Ⅱ是电子传递的两个入口复合体Ⅲ接收来自复合体Ⅰ和复合体Ⅱ的电子向下传递并伴随能量的产生所以通过复合体Ⅰ ＋Ⅲ、复合体Ⅱ ＋Ⅲ活性反映线粒体功能的变化是具有一定代表性的。肉苁蓉多糖使肝线粒体酶复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活力都有提高其机制可能是：①减少自由基生成从而减轻自由基对酶复合体的攻击；②使线粒体ＰＬＡ2活性降低以减少其有害代谢产物对酶复合体的损伤；③保证膜流动性的稳定使线粒体膜有一定的柔性从而保证了线粒体内膜上酶复合体的活性。
本实验表明肉苁蓉多糖可以提高机体抗氧化能力减少脂质过氧化产物减轻线粒体氧化损伤改善线粒体能量代谢达到延缓衰老的目的。
4 参考文献
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2 曾群力霍亚楠毛俊浩等∙肉苁蓉多糖的分离、纯化和鉴定〔Ｊ〕∙中草药2002；33（12）：1057-9∙
3 邵擎东肖建如杨金华等∙颈髓损伤对颈髓细胞线粒体膜流动性与线粒体呼吸功能的影响〔Ｊ〕∙中华创伤杂志2000；16（8）：469-70∙
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