摘要:目的　研究肉苁蓉多糖(polysaccharidesofCistanchedeserticola, PCD)对亚急性衰老小鼠组织丙二醛(MDA)含量、端粒酶活性和免疫功能的影响。方法　使用D-半乳糖造成小鼠亚急性衰老模型。硫代巴比妥酸比色法检测MDA含量;PCR-ELISA法检测端粒酶活性;MTT法测定淋巴细胞增殖反应;中性红实验测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能;酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中IL-2含量。结果　模型组小鼠心、肝和脑MDA含量明显增加, 端粒酶活性、淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量均显著下降。给予PCD后, 小鼠心、肝和脑MDA含量明显降低, 心和脑组织端粒酶活性, 淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量明显升高。结论　PCD能拮抗自由基损伤, 增强衰老小鼠心和脑组织端粒酶活性和机体免疫功能, 对D-半乳糖所致的衰老有一定的改善作用。

关键词:肉苁蓉多糖;丙二醛;端粒酶;免疫;衰老

肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)为列当科植物肉苁蓉的干燥带磷叶的肉质茎, 具有补肝肾、益精气的功用[ 1] 。肉苁蓉多糖(polysaccharidesofCistanchedeserticola, PCD)是从肉苁蓉中分离的粗多糖, 除去水溶性小分子杂质, 经Sevag法脱蛋白质,用水、醇反复处理得PCD[ 2] 。本实验从衰老的免疫学说和端粒学说入手, 采用D-半乳糖衰老小鼠模型, 观察PCD对其心、肝、脑丙二醛(MDA)含量及端粒酶活性的影响, 对其作用机制进行初步探讨。

1　材料与方法

1.1　动物、药物、试剂及仪器3月龄ICR小鼠, 清洁级, 26 ～ 32 g, 雌雄各半[扬州大学实验动物中心, 实验动物质量合格证号:SCXK(苏)2002-0009] 。室温20 ～ 25 ℃, 自然照明,实验前适应环境饲养1周。PCD由南京野生植物研

究所提供, 蒸馏水溶解;D-半乳糖(D-Gal, 上海试剂二厂);端粒酶活性检测试剂盒(美国MB公司);MDA检测试剂盒和小鼠IL-2 ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。ELX800UV酶标仪(美国BIO-TEK公司);PT-MR3100D组织匀浆机(瑞士Polytron公司);MODEL550台式冷冻离心机(德国Eppenddorf公司);BP110S电子天秤(德国Sartorius公司)。

1.2　动物分组、模型制备及给药按文献[ 3] 方法制备衰老小鼠模型。注射用水配制10%D-Gal, 小鼠颈背部皮下注射10 mL· kg-1每天1次, 连续6周。小鼠随机分为5组:正常对照组、模型对照组、PCD 25、50 和100 mg· kg-1组

(PL、PM、PH组), 每组12只。模型组和PCD给药组小鼠依法造模, 同时每天分别灌胃给予PCD25、50和100 mg· kg-1 , 容量为20 mL· kg-1 。正常对照组小鼠相应注射等体积的注射用水和灌胃给予等体积的生理盐水。

1.3　MDA含量和端粒酶活性的测定末次给药24 h后摘眼球取血, 处死小鼠, 快速摘取心、肝和脑, 在低温条件下进行新鲜组织匀浆,离心, 取上清。硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。PCR-ELISA法检测端粒酶活性, 操作步骤按试剂盒说明书进行, 酶标仪450 nm处测定A值。

1.4　淋巴细胞增殖反应测定[ 4]在超净工作台中无菌取出小鼠脾脏, 制备小鼠脾脏细胞悬液, 调细胞密度为1 ×109个· L-1 , 刀豆蛋白A(ConA)作为刺激原在体外培养48 h, MTT法测定细胞增殖反应。于酶联仪测波长570 nm测定

A值, 结果以3个复孔A的均值表示。

1.5　中性红法测定腹腔巨噬细胞吞噬功能末次给药24 h后, 小鼠脱颈处死, 无菌收集小鼠腹腔液, 1 000 r· min-1离心, Hanks液洗涤细胞3次, 1640培养液制备细胞悬液。取3 mL置培养皿中, 37 ℃, 5%CO2培养2 h, 巨噬细胞黏附于容器表面, 用4 ℃ Hanks液吹吸, 收集黏附细胞, 血球计数板计数并调整细胞密度为2 ×109个· L-1 , 置37 ℃培养箱培养2 h后, 弃上清和非贴壁细胞。取贴壁巨噬细胞, 加0.1% 中性红生理盐水, 37 ℃继续培养30 min, 弃中性红, 用37 ℃PBS反复冲洗巨噬细胞, 用体积分数50%乙酸和50%乙醇稀释后,测A值。

1.6　血清IL-2水平的测定

摘眼球取血, 离心(3 000 r· min-1 , 10 min)分离血清, 酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中IL-2含量, 具体操作根据试剂盒使用说明书, 酶标仪450 nm处检测各组小鼠血清中IL-2水平。

1.7　统计学分析

数据以SPSS11.0处理, 计量资料以均数±标准差( x±s)表示, 采用单因素方差分析和组间t检验。

2　结　果

2.1　PCD对衰老小鼠心、脑和肝MDA含量的影响与正常对照组比较, 模型组小鼠心、肝和脑的MDA含量明显增加(P<0.01)。灌胃给予PCD25、50和100 mg· kg-1后, 小鼠心、脑和肝MDA含量较模型组呈剂量依赖性降低(P<0.01, P<0.05), 高剂量组MDA含量接近正常水平(表1)。

2.2　PCD对衰老小鼠心、脑和肝组织端粒酶活性的影响

与正常对照组比较, 模型组小鼠心、肝和脑组织的端粒酶活性明显降低。灌胃给予PCD后, 能剂量依赖性升高心、脑组织中端粒酶活性, 高剂量组接近正常对照组水平。而对衰老小鼠肝脏组织端粒酶活性无明显影响(P>0.05)(表2)。

2.3　PCD对衰老小鼠淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和血清IL-2含量的影响与正常对照组比较, 模型组小鼠淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量均显著下降(P<0.01)。灌胃给予PCD后, 衰老小鼠的淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和血清IL-2含量剂量依耐性升高, 与模型组比较有差异性(P<0.01, P<0.05)(表3)。

3　讨　论

对于衰老产生的确切机制, 迄今尚不明确, 多年来, 国内外学者提出了数十种衰老学说, 如自由基学说, 分子氧是生物体生存所必需, 生物体内的营养物质通过氧化放出能量, 细胞的氧化状态在衰老, 肿瘤发生、发展中起着重要作用。但某些氧化过程中会形成自由基, 衰老与异常自由基反应密切相关。当自由基在体内积累过多时, 会引起体内尤其是生物膜的不饱和脂肪酸的过氧化, 导致细胞膜结构发生改变, 膜功能受损, 产生MDA、脂褐素(LPF)[ 5] 。

MDA是极其活泼的交联剂, 它能与蛋白质、酶以及核酸上游离的氨基酸共价交联成希夫碱, 因其具有异常键, 经溶酶体吞噬后不能被水解酶消化, 聚集于细胞成为脂褐质, 脂褐质能毒害细胞, 阻碍细胞内物质和消息的传递, 导致核加快细胞的衰老和死亡。因此MDA可作为器官、细胞衰老可靠标志。端粒学说认为染色体顶端的染色体(端粒)的长度与衰老和寿命密切相关, 端粒的长度大约2 ～15 kb, 由于存在末端复制问题, DNA每复制1次, 端粒DNA就会丢失50 ～ 200 bp, 随着细胞分裂次数的增加, 端粒DNA进行性地缩短, 缩短到一定限度后,便不能维持染色体的稳定, 细胞便失去了分裂增殖能力而衰老死亡, 这种缩短就是衰老的标志[ 6] 。细胞进入增殖衰竭期, 细胞继续存活但不能分裂增殖[ 7] 。因此, 端粒也被称为细胞的“生物钟”, 细胞的衰老决定着整个机体的衰老。Bryma研究发现,端粒的长度与端粒酶的活性有关, 端粒酶的活性越高, 端粒越长, 染色体的稳定性完整性越好, 细胞分裂次数增多, 寿命延长。免疫系统作为一个完整的、自主的系统在维护和调整生命活动中起着重要作用, 而免疫功能下降,又是衰老最突出的特征, 免疫功能失调可加速机体的衰老[ 8] 。本实验结果显示, PCD能明显减少心、脑和肝组织中MDA含量, 提高衰老模型小鼠心、脑组织端粒酶活性, 以及衰老小鼠淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量。由此推断, PCD在拮抗自由基损伤方面具有良好作用,并且可以促进淋巴细胞增殖, 提高机体非特异性细胞免疫和免疫调节功能, 起到延缓机体老化的作用。

REFERENCES

[ 1] 　MA ZG.DifferentofProcessedCistanchesinensisG.BeckandHerbaCistanchebyHPLCFingerprints[ J] .ChinPharmJ(中国药学杂志), 2011, 46(12):899-902.

[ 2] 　SHIHF, LINAP, ZHANGH Q, etal.TheeffectofpolysaccgridesofCistanchedeserticolaY.C.Maonspleendeficiencysyndromerats[J] .ChinWildPlantRes(中国野生植物资源),2000, 19(6):49-51.

[ 3] 　XU SY, BIAN RL, CHENX.MethodoldgyofPharmacologicalExperiments)(药理实验方法学)[ M] .Vol3.Beijing:People' sMedicalPublishingHouse, 2002:1465-1466.

[ 4] 　LIUYQ, SUW, WUJJ, etal.Effectofcynomorium coccineumextractiononimmunityfunctionandfreeradicalmetabolismofagingmice[J] .JCellMolImmunol(细胞与分子免疫学杂志),2009, 25(1):1155-1157.

[ 5] 　YANGH J, WANGZL, XUESH.Progressinstudiesofagingmechanism[ J] .ChinJControlEndem Dis(中国地方病防治杂志), 2008, 23(1):35-37.

[ 6] 　YANGJ, ZHANXH, SUNY, etal.Effectofsijunzidecoctiononmalondialdehydecontentandtelomeraseactivityinheart, liverandbraintissuesodD-galactoseinducedagingmodelmice[ J] .ChinJIntegrTraditChinWestMed(中国中西医结合杂志), 2005, 25(6):531-533.

[ 7] 　ZHANGXH, ZHANGJN.Telomere, telomerase, agingandcancer[J] .IntJGenetics(国际遗传学杂志), 2007, 30(1):69-71.

[ 8] 　SONGSX, LVZJ.ResearchprogressofT、Bcellsenescenceanditsmolecularmechanism[ J] .JCellMolImmunol(细胞与分子免疫学杂志), 2002, 18(3):306-308.