摘 要：目的：建立肉苁蓉多糖的含量测定方法。方法：以精制肉苁蓉多糖测得肉苁蓉多糖对葡萄糖的换算因子，利用苯酚-硫酸法测定肉苁蓉多糖含量。结果：测得肉苁蓉生药中多糖含量12.0%，平均回收率为99.81%，

RSD=2.67%（n =6）。结论：该方法简便，可行，可用于肉苁蓉多糖的含量测定。

关键词：肉苁蓉多糖；苯酚- 硫酸法；含量测定

肉苁蓉（Herba Cistanche） 是列当科（Orobanchaceae）肉苁蓉属（Cistanche）植物肉苁蓉干燥带鳞叶的肉质茎，又名地精、金笋、苁蓉、大芸。具有补肾壮阳、润肠通便的功效[1]。近年来，国内外对肉苁蓉多糖开展了大量的研究工作，表明其具有抗氧化、抗衰老、调节免疫功能及促进造血等药理活性。本文采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，为开发利用肉苁蓉多糖提供一定的依据。

1 材料与实验仪器

1.1 材料

肉苁蓉药材来自内蒙古阿拉善，经张丽娟教授鉴定为荒漠肉苁蓉。葡萄糖对照品为分析纯。苯酚为重蒸酚，购自北京鼎国生物技术有限责任公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司（上海）；GL-21M高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅，天津中兴伟业仪器有限公司；LGJ-10D型冷冻干燥机，北京四环科技仪器厂有限公司；旋转蒸发器RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ZHWY-200H恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。

2 多糖的提取与精制[2]

取经切片的肉苁蓉药材1000g，以95% 乙醇回流提取2次。残渣挥干溶剂后，再分别以12倍、10倍水各回流提取1次，每次2h，合并水提液并浓缩，离心去除不溶物。向肉苁蓉水提液中加入95% 乙醇，直至溶液中乙醇的体积分数为80%，置于4℃冰箱24h，离心并将沉淀以80%乙醇洗涤至上清液无色，真空干燥即得到肉苁蓉粗多糖。将肉苁蓉粗多糖配成5% 溶液，用sevag 试剂（氯仿∶正丁醇= 4 ：1）混合，充分振摇后静置离心，除去蛋白层，此过程反复多次，直至多糖溶液在280nm 处无紫外吸收。再将肉苁蓉粗多糖配成2% 溶液，加入双氧水使其浓度为7%，用NaOH 调pH=9，放入摇床55℃脱色5h。脱色液浓缩后用透析袋除盐，冷冻干燥得淡黄色固体。即得精制肉苁蓉多糖。

3 多糖含量的测定

3.1 标准曲线的绘制[3]

3.1.1 标准系列溶液的配制

精密称定105 ℃ 干燥至恒重的无水葡萄糖50mg，定容于50mL容量瓶中，摇匀，配制成浓度为1mg/mL的储备液。从储备液中分别精密移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 置于6 个50mL容量瓶中，定容，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 和0.06mg/mL的葡萄糖标准系列溶液。

3.1.2 苯酚溶液的配制

称取苯酚20g，加入蒸馏水5g，即为80%的苯酚溶液，冰箱中密封避光长期保存。取密封避光保存的80%苯酚溶液，放置于室温，精密移取3mL置于 37mL蒸馏水中，即为6%的苯酚溶液，临用前现配。

3.1.3 标准曲线的绘制

精密移取葡萄糖标准系列溶液各1.0mL，空白取1.0mL水，分别置于试管中，各加6%的苯酚1.0mL后充分振摇，再迅速加入浓硫酸5.0mL，振摇，沸水浴加热5min，放置室温后于490nm处测定吸光度。以吸光度（A）对葡萄糖浓度（C）对进行线性回归，得回归方程A=11.30C-0.017。R2=0.998葡萄糖对照品在0.01~0.06mg/mL范围内的线性关系良好。

3.2 换算因子的计算

精密称定60℃干燥至恒重的肉苁蓉精制多糖25mg，定容于25mL容量瓶中，配制成浓度为1mg/mL的储备液。从中精密移取2mL置于100mL的容量瓶中，定容，配制成0.02mg/mL 的待测溶液。精密移取精制多糖的待测溶液1.0mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度。按f=C/C'D 计算换算因子，C为精制多糖浓度（mg/mL），C'为所测多糖浓度（mg/mL），D为样品溶液稀释的倍数，测得f=1.67（n =3）。3.3 粗多糖的含量测定精密称定60℃干燥至恒重的肉苁蓉粗多糖50.0mg，定容于50mL容量瓶中，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。从中取出1mL置于50mL 的容量瓶中，定容，配制成0.02mg/mL的待测溶液。精密移取粗多糖的待测溶液1.0mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度。多糖含量= f C'D/C，C'为所测多糖浓度（mg/mL），D为样品溶液稀释的倍数，C为样品的浓度，测得肉苁蓉粗多糖部位中多糖的质量分数为78%，相对标准偏差（RSD）为1.23%（n =6）。再乘以得率15.39%，得生药中平均多糖含量为12%。

3.4 精密度试验

精密移取肉苁蓉粗多糖待测液1.0mL，按测定标准曲线的方法测定其吸光度，平行测定6份，吸光度平均值为0.264，RSD为1.16%，表明此方法精密度良好。

3.5 显色稳定性试验

精密移取肉苁蓉粗多糖待测液1.0mL，按测定标准曲线的方法分别于0、1、2、3、4、5h测定其吸光度，吸光度平均值为0.264，RSD为0.43%，表明样品在5h内显色稳定。

3.6 加样回收率试验

精密移取已知含量的肉苁蓉粗多糖样品溶液0.5mL 6份，分别加已知含量的葡萄糖溶液0.5mL，摇匀，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，实验结果见表1。测定平均加样回收率为99.81%，RSD为2.67%（n =6），表明该方法的准确度良好。

4 讨 论

苯酚-硫酸法是测定多糖的常用方法，该方法的基本原理是：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚结合生成有色化合物，在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系[4]。但是不同单糖与硫酸-苯酚试剂显色后的最大吸收波长在490nm附近有一定差异，对于杂多糖，单纯以某一含量较高的单糖作标准曲线来计算多糖含量仍与真实含量存在较大误差。本文参考了改进苯酚-硫酸法测定芦荟多糖含量的方法[5]。采用测定换算因子的校正方法，可有效消除用葡萄糖标准曲线计算多糖含量而带来的误差，测得值更接近真实值。本研究还考察了试验过程中水浴对试验结果的影响，结果表明加入浓硫酸后沸水浴加热5min，放置室温，可获得准确的吸光度和良好的重现性。

多糖是荒漠肉苁蓉中重要组成部分，主要由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖等组成；具有多种生物活性如抗氧化、抗衰老、调节免疫功能及促进造血等，且毒副作用小，无论在临床应用还是保健类食品开发方面都有着广阔的前景。因此肉苁蓉中多糖含量测定结果的准确性，对开发和利用肉苁蓉多糖有一定的参考意义。本文采用苯酚-硫酸法操作简便、显色稳定、重现性好、灵敏度高，可作为肉苁蓉多糖及其他多糖的含量测定方法。◆

参考文献

[ 1 ] 李媛，宋媛媛，张洪泉.肉苁蓉的化学成分及药理作用研究进展[ J ] .中国野生植物资源，2010，29 ( 1 ) ：7-11.

[ 2 ] 孙磊，乔善义，赵毅民.黑骨藤多糖含量测定方法研究[ J ] .中国中药杂志，2009，34 ( 10 ) ：1241-1244.

[ 3 ] 程迪，于洁，董丽.河南产牡丹皮中多糖含量的测定[ J ] .安徽农业科学，2008，36 ( 2 ) ：518.

[ 4 ] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[ M ] . 上海：上海科学技术出版社，1987 ：6.

[ 5 ] 钱和，张添，刘长虹.改进苯酚-硫酸法测定芦荟多糖含量[ J ] .江苏食品与发酵，2002，109 ( 2 ) ：3-6.