摘要　[ 目的]提取肉苁蓉多糖并测定其抑菌作用。[ 方法] 采用热水浸提法提取肉苁蓉多糖, 在单因素试验的基础上, 通过3因素3水平正交试验优化肉苁蓉多糖提取工艺。[ 结果] 各因素对多糖得率的影响依次为浸提温度>水料比>浸提时间。最佳提取工艺为以1∶15的料水比在85 ℃下浸提2 h, 利用该工艺提取肉苁蓉多糖的平均得率为6.785 7 mg/g。肉苁蓉多糖溶液对四叠球菌的抑制作用最强, 其抑菌圈直径为11.20 mm, 其次为枯草芽孢杆菌, 其抑菌圈直径为10.24 mm。肉苁蓉多糖溶液对啤酒酵母的抑制作用较强, 其抑菌圈直径为8.16 mm, 对黑曲霉和米曲霉的抑菌作用不明显。肉苁蓉多糖溶液对大肠杆菌、四叠球菌、枯草杆菌、啤酒酵母和橘青霉的最小抑菌浓度分别为0.437、0.109、0.218、0.437和0.874 mg/ml。[结论] 该研究为肉苁蓉在更多领域中的合理开发和利用奠定了基础。

关键词　肉苁蓉;多糖;提取工艺;抑菌作用;最小抑菌浓度

肉苁蓉(CistanchedeserticolaMa)为列当科肉苁蓉属多年生草本植物, 全世界约有20种, 我国有6种, 主要分布于内蒙古、新疆、甘肃和宁夏等地[ 1 -2] 。由于肉苁蓉生长环境严酷,气候极端干旱, 多生长在荒漠中, 具有极好的药用价值,素有“沙漠人参”之美誉[ 3 -4] 。文献报道肉苁蓉含有多糖、苯乙醇苷、生物碱、有机酸等多种成分[ 5] 。而多糖类成分在增强机体免疫功能、抗肿瘤方面的作用愈来愈受到人们的重视,其中对免疫增强作用的机理研究已深入到分子、受体水平。但对肉苁蓉多糖的抑菌作用研究还未见报道。笔者主要对肉苁蓉多糖的提取工艺及抑菌性能进行研究, 旨在使这种名贵、稀有的中药材在更多的领域得到更好的、更合理的开发和利用。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　试验材料。肉苁蓉植株采于甘肃白银平川区野外。

1.1.2　试验药品。葡萄糖、95%乙醇、浓硫酸、苯酚、正丁醇、三氯甲烷等试剂均为国产分析纯。

1.1.3　供试菌种。枯草杆菌(Bacillussubtilis), 大肠杆菌(Escherichiacoli), 四叠球菌(Micrococcusterragenus), 啤酒酵母(Scerevisiaehensen),米曲霉(A.oryzae), 橘青霉(Penicilliumsp.),黑曲霉(Aspergillusnigers)。以上菌种均由河西学院生命科学与工程系微生物实验室提供。

1.1.4　试验仪器。电子分析天平;超净工作台;复日菌落计数器;青岛-利勃海尔电冰箱;日本ALP全自动高压灭菌锅;DPX-9272B-1电热恒温培养箱;MJX智能霉菌培养箱;FGZX101-3S电热恒温鼓风干燥箱。

1.1.5　培养基[ 6] 。PDA培养基:去皮马铃薯200 g, 琼脂20g, 蔗糖20 g, 水1 000 ml, pH自然, 121 ℃灭菌20 min。NA培养基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g, 氯化钠5 g, 琼脂15 ～ 20 g, 水1 000 ml, 121 ℃灭菌20 min。

1.1.6　菌悬液。将相对应的试验菌种接种在斜面培养基上, 细菌37 ℃活化18 h,真菌32 ℃ 活化24 ～ 48 h。以无菌生理盐水配制成菌悬液(107 ～ 108 CFU/ml)备用。

1.2　方法

1.2.1　肉苁蓉多糖的提取。

1.2.1.1　肉苁蓉多糖提取工艺流程。干燥肉苁蓉粉末※95%乙醇浸泡2 h※烘干※热水浸提※过滤除渣※醇沉24 h※离心去上清液※沉淀物溶解定容至50 ml※Ssevage法除蛋白※再次定容至50 ml※测吸光度。

1.2.1.2　肉苁蓉多糖提取方法。准确称取肉苁蓉粉末3 g,加95%乙醇浸泡2 h后, 过滤, 取滤渣,于80 ℃烘箱内烘干。以提取温度、水料比和提取时间为试验因素, 在单因素试验的基础上按表1进行正交试验,提取多糖。每组提取次数均为2次, 然后合并滤液, 浓缩滤液至原体积的1 /5, 浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇, 充分搅拌后置冰箱过夜沉淀。弃上清, 3 000 r/min离心10 min, 收集沉淀。沉淀用适量蒸馏水溶解并定容至100 ml, 置于分液漏斗, 按照1 ∶1 量加入Sevage试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1), 振荡30 min, 静置,分离数次。直到没有乳白色变性蛋白质析出为止, 收集上清液, 定容至50 ml待用。

1.2.1.3　多糖含量的测定。采用苯酚-硫酸法[ 7] 。取样品1 ml,加入1 ml蒸馏水再加入1 ml质量分数为5%的苯酚溶液和5 ml浓硫酸摇匀后于25 ℃静置20 min, 于波长490 nm处测其吸光值,根据标准曲线即得多糖含量。

1.2.2　肉苁蓉多糖提取物抑菌性检测。

1.2.2.1 　抑菌试验。将多糖提取物配制成浓度为1.748mg/ml的溶液, 采用圆纸片法测定其抑菌活性。分别刮取活化后的供试菌(7种)菌苔于50 ml生理盐水中, 振荡摇匀得菌悬液,分别用移液枪注入0.2 ml于培养基平板上,涂匀,取

已消过毒的圆形滤纸(￠6 mm)用糖液浸泡过夜。捞出略干后贴于培养基平板上。在恒温培养箱中培养(细菌36 ～ 37℃, 18 ～ 24 h;真菌28 ～ 30 ℃, 48 ～ 72 h)后分别观察其抑菌性。以上步骤均按无菌条件操作, 每个样品设2个平行, 结果取平均值。

1.2.2.2　最小抑菌浓度的测定。采用圆纸片法[ 8-9] , 方法同上,将多糖溶液稀释成1.748、0.874、0.437、0.218 5、0.109 25mg/ml的浓度梯度, 以未见抑菌圈的最高浓度为MIC[ 10 -11] 。

2　结果与分析

2.1　肉苁蓉多糖热水浸提法最佳条件的确定　肉苁蓉多糖热水浸提法浸提次数均为2次,影响热水浸提法的因素主要有浸提温度、浸提时间和水料比。试验在单因素试验的基础上采用3因素3水平正交法确定最佳浸提条件。

由表2的极差分析结果可见, 影响肉苁蓉热水浸提法的因素主次顺序是A、C、B。由试验结果分析可知, 3个因素的最佳组合是A2B2C2,即浸提温度85 ℃,浸提时间2 h,加水量为1∶15。

　试验结果表明,浸提温度对多糖获得量的影响最大。85℃浸提多糖获得量最多, 随着温度的升高得量反而下降。浸提温度过高, 可能破环了多糖的结构, 使多糖含量降低;浸提温度太低时, 不利于多糖的彻底溶出。溶剂的用量增大, 有利于多糖溶出, 水料比为15∶1时, 所得多糖最多, 表明这时多糖溶解较充分。水料比太小, 多糖不能完全溶解, 造成提取不完全;水料比太大, 在浓缩、回收时比较困难, 造成浪费。当浸提时间为2 h时所得多糖的量最多, 随着时间的延长, 多糖量反而减少。这可能是由于浸提时间过长, 多糖在水中的溶出趋于平衡,多糖量提高很少。

2.2　肉苁蓉多糖提取物的抑菌作用　图1是肉苁蓉多糖溶液对四叠球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母的抑菌作用结果。由图1可见,肉苁蓉多糖溶液对供试菌种具有抑菌活性。

　肉苁蓉多糖提取物对大肠杆菌、四叠球菌、枯草杆菌、啤酒酵母、橘青霉的抑菌圈直径分别为8.96、11.20、10.24、8.16、7.84 mm。由此可见,肉苁蓉多糖溶液对3种供试细菌都有抑制作用, 其中对四叠球菌的抑制作用最强,抑菌圈直径达11.20 mm, 其次为枯草芽孢杆菌,抑菌圈直径达10.24mm。供试的4种真菌中肉苁蓉多糖提取物对啤酒酵母、橘青霉有抑制作用,其中对啤酒酵母的抑制作用较强, 抑菌圈直径达8.16 mm,对黑曲霉和米曲霉的抑菌作用不明显。肉苁蓉多糖提取物抗菌活性结果表明,肉苁蓉多糖提取物对一些细菌与真菌都显示了不同程度的抑制作用, 说明肉苁蓉多糖在抗动植物病原菌方面有潜在应用价值。

2.3　最小抑菌浓度(MIC)的测定　肉苁蓉多糖提取物对大肠杆菌、四叠球菌、枯草杆菌、啤酒酵母、橘青霉的MIC分别为0.437、0.109、0.218、0.437、0.874。由此可见,肉苁蓉多糖提取物对四叠球菌的最小抑菌浓度在所试菌种中浓度最小, 表明四叠球菌是测定肉苁蓉多糖MIC的较好指示菌,肉苁蓉多糖提取物对橘青霉的MIC最高。

3　结论与讨论

通过正交试验对肉苁蓉多糖的提取工艺进行研究, 确定肉苁蓉多糖提取结果的诸因素及其主次顺序为提取温度>水料比>提取时间, 肉苁蓉多糖的最佳提取工艺为:以蒸馏水为提取剂、提取温度85 ℃、提取时间2 h、水料比15∶1。在此条件下, 肉苁蓉多糖含量可达6.785 7 mg/g。用滤纸片法对肉苁蓉多糖提取物进行抑菌性研究, 结果表明肉苁蓉多糖具有一定的抑制细菌及真菌生长的作用。对细菌的抑制作用明显强于对真菌的抑制作用。在供试的3种细菌中肉苁蓉多糖提取物对四叠球菌的抑制作用最大, 抑菌圈直径达11.20 mm。肉苁蓉多糖的最小抑菌浓度(MIC)因菌种不同而不同。肉苁蓉多糖提取物对四叠球菌的最小抑菌浓度为0.109 mg/ml, 在供试菌种中浓度最小。所以四叠球菌可以作为测定肉苁蓉多糖MIC的较好指示菌。

参考文献

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