摘要: 优选肉苁蓉多糖的脱蛋白工艺，为肉苁蓉多糖纯化提供试验依据。以脱蛋白率为指标，比较Sevag 法、酶法及酶－ Sevag 联合法对肉苁蓉粗多糖的脱蛋白效果，采用正交试验优选最佳工艺。结果表明，Sevag 法优于酶法和酶－Sevag 联合法，Sevag 法脱蛋白的最佳工艺为: 三氯甲烷与正丁醇的体积配合比4 ∶ 1，料液体积比1 ∶ 3，搅拌40 min，脱蛋白4 次。在该工艺下平均脱蛋白率为87． 11%，ＲSD 为1． 34%; 平均多糖保留率为83． 05%，ＲSD 为1. 54%。试验证明该工艺稳定可靠，适用于肉苁蓉多糖的纯化。

关键词: 肉苁蓉多糖; 脱蛋白; Sevag 法; 酶法; 酶－ Sevag 联合法; 正交试验

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉( Cistanche deserticola Y． C．Ma) 或德赢vwin登录 ［C． tubulosa ( Schrenk) Ｒ． Wight］的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳、益精血、润肠通便和延缓衰老等功效［1］。肉苁蓉多糖是肉苁蓉的主要活性成分之一，有研究表明肉苁蓉多糖具有延缓衰老、增强机体免疫功能，促进人体外成纤维细胞的生长及促进创伤愈合等生理活性作用［2］。植物多糖通常还有较多的蛋白质，会影响多糖的活性，所以须对多糖进行脱蛋白以达到对纯化多糖的目的。目前，多糖脱蛋白的方法主要有Sevag 法、三氯乙酸法、酶法等［3］。如殷洪梅等采用Sevag 法对金银花多糖进行脱蛋白研究［4］; 龚力民等对Sevag 法、酶法及酶－ Sevag 联合法脱五倍子多糖蛋白进行比较［5］; 蔡彬新等采用三氯乙酸法脱除海地瓜多糖中的蛋白质［6］。本试验通过3 种不同的方法单独或联合对肉苁蓉粗多糖进行脱蛋白研究，并对其脱蛋白工艺进行优化，以期获得高纯度肉苁蓉多糖，为肉苁蓉制剂及其保健品开发提供科学的依据。

1 材料与方法

1． 1 材料与仪器

肉苁蓉，购自江西诚欣医药有限公司; 木瓜蛋白酶( 食品级) ，河南郑州绿源生物科技有限公司; 其他化学试剂均为分析纯; 试验用水为蒸馏水。电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司; 电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司; T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司; 数显恒温水浴锅，江苏常州国华电器有限公司; Bq5200B 型超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司; SHZ － IIIB 循环水真空水泵，上海仪表集团供销公司。

1． 2 试验方法

1． 2． 1 肉苁蓉粗多糖的提取工艺流程肉苁蓉粗多糖的提取工艺流程如图1 所示。

1． 2． 2 肉苁蓉多糖含量的测定

1． 2． 2． 1 葡萄糖标准曲线方程的建立以葡萄糖为对照品，采用苯酚－ 硫酸法［7］测定肉苁蓉多糖含量，其标准曲线方程为D = 14． 017ρ + 0． 000 2，r2 = 0． 997 5，ρ 为多糖溶液的质量浓度，线性范围为0． 01 ～ 0． 05 mg /mL。

1． 2． 2． 2 多糖保留率的计算多糖保留率= ρ2 /ρ1 × 100%。( 1)式中: ρ1为脱蛋白前粗多糖中肉苁蓉多糖的质量浓度; ρ2为精制后肉苁蓉多糖的质量浓度。

1． 2． 3 蛋白质含量测定

1． 2． 3． 1 蛋白质标准曲线方程的建立以牛血清白蛋白为对照品，采用考马斯亮蓝法［8］测定蛋白质含量，其标准曲线方程为D = 8． 097ρ + 0． 029 8，r 2 = 0． 995 4，ρ 代表蛋白质溶液的质量浓度，线性范围为0． 02 ～ 0． 10 mg /mL。

1． 2． 3． 2 蛋白质脱除率的计算蛋白质脱除率= ( ω1 － ω2) /ω1 × 100%。( 2)式中: ωj为脱蛋白前粗多糖中蛋白质的质量分数; ω2为精制后蛋白质的质量分数。

1． 2． 4 肉苁蓉多糖脱蛋白方法

1． 2． 4． 1 Sevag 法脱蛋白取“1． 2． 1”节下制备的粗多糖2 g 溶于50 mL 水中，加入12． 5 mL 的Sevag 试剂( V三氯甲烷∶ V正丁醇= 4 ∶ 1) ，磁力搅拌30 min 后离心10 min; 弃去沉淀，上清液用3 倍体积量的95%乙醇沉淀，沉淀经洗涤干燥后得精制多糖，测定精制多糖中的多糖含量和蛋白质含量。

1． 2． 4． 2 酶法脱蛋白取“1． 2． 1”节下制备的粗多糖2 g 溶于50 mL 水中，加入10 mg 木瓜蛋白酶，于60 ℃下酶解2 h，离心10 min; 弃去沉淀，上清液用3 倍体积量的95% 乙醇沉淀，沉淀经洗涤干燥后得精制多糖，测定精制多糖中的多糖含量和蛋白质含量。

1． 2． 4． 3 酶－ Sevag 联合法脱蛋白按上述酶法制备得到的上清液加入1 /4 量的Sevag 试剂，再搅拌和离心处理后制备精制多糖，测定精制多糖中的多糖含量和蛋白质含量。

1． 2． 5 肉苁蓉多糖脱蛋白工艺优化影响Sevag 法脱蛋白的因素主要有三氯甲烷与正丁醇的体积比( V三氯甲烷∶ V正丁醇) 、料液比( Sevag 试剂与多糖溶液体积比) 、搅拌时间和脱蛋白次数。选择各因素的3 个水平值，按Sevag 法脱蛋白工艺进行L9( 34 )正交试验( 表1) ，试验结果以脱蛋白率为判断依据，以综合评价作为参考。综合评价率采用综合加权评分法，评分公式为:综合评价率= ( 脱蛋白率+ 多糖保留率) × 50%。

从表2 可知，Sevag 法和酶－ Sevag 联合法脱蛋白的效率相对较高，而酶法多糖的保留率相对较高。这可能是因为肉苁蓉多糖中的蛋白质以游离型居多，结合型较少，Sevag 法能更加有效地除去游离型蛋白质，而酶法主要酶解结合型蛋白质。2 个因素综合考虑，Sevag 法更适合于肉苁蓉多糖的脱蛋白工艺。

2． 2 Sevag 法正交试验结果

由表3 的极差分析可知，Sevag 法各因素对肉苁蓉多糖脱蛋白的影响顺序依次为A ＞ C ＞ D ＞ B，即三氯甲烷与正丁醇的体积比影响最大，其次为搅拌时间、脱蛋白次数、料液比。Sevag 法脱蛋白的最佳工艺为A2B1C3D3

，即三氯甲烷与正丁醇的体积比为4 ∶ 1，料液体积比为1 ∶ 3，搅拌时间40 min，脱蛋白次数4 次。这主要是因为随着搅拌时间的增加，Sevag 试剂与蛋白质结合增多，脱蛋白率提高; 脱蛋白次数的增加固然能提高脱蛋白率，但是多糖损失得也会更多，可能会造成综合效果不佳。对上述最佳工艺进行验证，重复操作3 次，得出该工艺下平均脱蛋白率为87． 11%，ＲSD 为1． 34%; 平均多糖保留率为83． 05%，ＲSD 为1． 54%。结果表明该工艺脱蛋白率高，综合效果良好。

3 结论

Sevag 法适用于肉苁蓉多糖脱蛋白工艺，通过正交试验优选出肉苁蓉脱蛋白的最佳工艺为: 三氯甲烷与正丁醇的体积配合比4 ∶ 1，料液体积比1 ∶ 3，搅拌40 min，脱蛋白4 次。在该工艺水平下平均脱蛋白率为87． 11%，ＲSD 为1． 34%; 平均多糖保留率为83． 05%，ＲSD 为1． 54%。试验证明该工艺稳定可靠，适用于肉苁蓉多糖的纯化。

参考文献:

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［2］Schepetkin I A，Quinn M T． Botanical polysaccharides: macrophageimmunomodulation and therapeutic potential［J］． International Immunopharmacology，2006，6( 3) : 317 － 333．

［3］卢艳花． 中药有效成分提取分离技术［M］． 北京: 化学工业出版社，2005: 298．

［4］殷洪梅，尚强，萧伟． 金银花多糖脱蛋白方法的研究［J］． 中草药，2010，41( 4) : 584 － 586．

［5］龚力民，刘伟，张楚晗，等． 五倍子多糖脱蛋白方法的研究［J］．湖南中医药大学学报，2013，33( 3) : 44 － 46．

［6］蔡彬新，吴成业，刘淑集． 海地瓜多糖提取条件的优化和脱蛋白的研究［J］． 食品工业科技，2009，30( 10) : 194 － 196，199．

［7］麻景梅，宋新波，张丽娟，等． 肉苁蓉多糖含量测定［J］． 辽宁中医药大学学报，2012，14( 8) : 100 － 101．

［8］乔茜茜，祁英，孙建忠，等． 啤酒花多糖的提取及脱蛋白工艺研究［J］． 食品工业科技，2012，33( 16) : 251 － 256．