［摘要］ 目的: 探讨咖啡酸类小分子肉苁蓉苷F 与牛血清白蛋白的结合反应特性。方法: 运用荧光光谱( FS) 、紫外-可见光谱( UV) 和圆二色谱( CD) 法探讨了生理条件下肉苁蓉苷F( 该化合物为作者首次从紫珠属植物中分离得到，简记为CF) 与牛血清白蛋白( BSA) 的相互作用。结果: 计算得到CF-BSA 的静态表观结合常数( Ka) ，结合位点数( n) ，能量转移效率( E) ，空间距离( r) ，热力学参数ΔG，ΔH，ΔS，与CF 作用前后BSA 中α-螺旋结构含量的变化，明确了CF 在BSA 上的结合位置，分析了几种常见金属离子对CF 与BSA 相互作用的影响。结论: CF 与BSA 形成基态复合物可导致BSA 内源荧光猝灭，其在BSA 上的结合位点数约为1， 25 ℃时的结合常数Ka为4. 36 × 104 L·mol － 1 ，二者之间的空间距离r 为3. 09 nm，结合过程主要表现为氢键作用，CF 在BSA 上的作用位点为site I，Mg2 ⁺ ，Fe3 ⁺ ，Cu2 ⁺ ，Zn2 ⁺ 的存在增强了CF 与BSA 的结合作用。猝灭机制主要为静态猝灭和非辐射能量转移。CD 光谱表明CF 对BSA 的空间构型改变有一定的影响。

［关键词］ 肉苁蓉苷F; 牛血清白蛋白; 荧光猝灭; 作用位点

血清白蛋白作为生命体血浆中最丰富的载体，具有贮运内源性代谢产物和外源性小分子等重要生理功能，是药物发挥药效的重要载体和靶分子。药物进入血液后，首先通过血浆的结合和贮存，然后在体内运输，达到受体部位、进而发生药理作用。因此，研究中药小分子与血清白蛋白相互作用，有助于了解药物在体内的运输和代谢机制，对于阐明药物作用机制具有重要的理论意义。荧光光谱、紫外-可见光谱和圆二色谱是研究药物与蛋白质相互作用的重要手段［1］。

咖啡酸类衍生物具有抗菌、抗病毒及增强机体免疫等功能。然而，这类中药小分子与蛋白的结合研究鲜有报道，查阅文献仅发现咖啡酸［2］、氯原酸［3］分别与蛋白的相互结合研究。由于这2 个小分子结构中不含糖基，因此研究结果未涉及糖基对该类药物与蛋白结合的影响。本文采用荧光、紫外-可见、圆二色谱法研究了生理条件下结构中含双糖的咖啡酸类小分子肉苁蓉苷F( 该化合物为作者首次从紫珠属植物中分离得到，简记为CF，结构见图1)

与BSA 的相互作用，测定了荧光猝灭常数，结合常数，能量转移效率，荧光给体与受体之间的距离及CF 在BSA 上的作用位点，同时研究了Mg2 + ，Fe3 + ，Cu2 + ，Zn2 + 金属离子对CF 与BSA 结合作用的影响。这些研究旨在为进一步探讨CF 在生命体内的运输和代谢作用机制提供理论参考依据。

1 材料与方法

1. 1 材料F2500 荧光光度计( Hitachi 公司) ，UV1000 紫外-可见光谱仪( 上海天美科学仪器有限公司) ，pHS-25 型pH 计( 上海精密科学仪器有限公司) ，DKB-501A 型超级恒温水槽( 上海森信实验仪器有限公司) ，CHIRASCAN 圆二色光谱仪( 英国应用光物理公司) ，VG ZAB-HS 质谱仪( 英国VG 公司) ，AVANCE-400 超导核磁共振仪( 瑞士Bruker 公司) ，伊利特P 230 双泵高效液相色谱仪( 大连伊利特分析仪器有限公司) 。

CF( 从紫珠属植物藤紫珠中分离得到，经MS，NMR 确定结构，HPLC-UV 面积归一化法测定纯度大于98%) 溶液: 准确称取0. 015 6 g CF，蒸馏水溶解，定容于25 mL 量瓶，配制成浓度为1. 28 × 10 － 3mol·L － 1的溶液，4

℃以下避光保存。BSA( Sigma 公司，纯度99%) 溶液: 准确称取0. 068 0 g BSA，蒸馏水溶解，定容于50 mL 量瓶，配制成2. 0 × 10 － 5 mol·L － 1溶液，4℃以下避光保存。保泰松( 百灵威有限公司，纯度99%) 和布洛芬( 百灵威有限公司，纯度98%) 溶液: 分别称取保泰松0. 015 4 g 和布洛芬0. 010 3 g，20 mL 乙醇溶解，转移至50 mL 量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，分别配制成浓度为1. 00 × 10 － 3 mol·L － 1 的保泰松和布洛芬储备液，避光保存。实验过程中所用试剂均为分析纯，水为双蒸水。

1. 2 荧光光谱测定移取浓度为2. 0 × 10 － 5 mol·L － 1的BSA 溶液50 μL 于4 mL 石英吸收池中，加入pH 7. 40 的Tris-HCl 缓冲液2. 5 mL。用微量注射器进行荧光滴定，每次加入10 μL CF 溶液后，混合均匀，静置5 min，以280 nm 为激发波长，入射和发射狭缝分别为5 nm，在荧光光度计上记录300 ～ 500nm 的发射光谱。并在Δλ 为15，60 nm 分别测量BSA 同步荧光光谱。

1. 3 能量转移的测定分别测量300 ～ 500 nm 处的1. 0 × 10 － 5 mol·L － 1BSA 及其与CF 摩尔比为1∶1 时体系的荧光光谱( 荧光实验条件同上) ，以及300 ～ 500 nm 处1. 0 × 10 － 5 mol·L － 1 CF 的紫外-可见吸收光谱。

1. 4 紫外光谱的测定移取浓度为2. 0 × 10 － 5 mol·L － 1的BSA 溶液1. 3 mL 于比色皿中，加入Tris-HCl 缓冲液1. 3 mL，用微量注射器进行紫外滴定，每次加入10 μL CF 溶液，混合均匀，静置5 min，分别测其200 ～ 500 nm 溶液紫外-可见吸收光谱，狭缝宽0. 5 nm，Tris-HCl 缓冲液为参比溶液。

1. 5 圆二色谱的测定25 ℃下测定200 ～ 250 nm处CF 与BSA 作用前后的CD 光谱。所测BSA 浓度为2. 0 × 10 － 6 mol·L － 1，池径为1 mm，每份溶液平均扫描3 次。实验结果用摩尔椭圆率( ［θ］) 表示，Tris-HCl 缓冲液为参比溶液。

1. 6 竞争试验在石英吸收池中固定标记物( 保泰松或布洛芬) 和BSA 的浓度均为1. 13 × 10 － 6 mol·L － 1，每次加入2 μL CF 溶液， 25 ℃下分别测量在不同标记物存在下的BSA 和CF 相互作用的荧光光谱。

1. 7 金属离子的影响将金属离子和CF 溶液混合，浓度均为1. 2 × 10 － 3 mol·L － 1，用微量注射器每次移取10 μL 混合液，加入到浓度为4. 0 × 10 － 7 mol·L － 1的BSA 溶液中进行荧光滴定。

2 结果与讨论

2. 1 肉苁蓉苷F 对BSA 的荧光猝灭作用BSA 分子是内源性荧光物质，在280 nm 激发波长下，BSA的最大发射波长为340 nm，同时考察了CF 在此条件下无荧光峰干扰，结果见图2。在实验条件下保持BSA 浓度不变，随着CF 浓度的不断增加，BSA 在340 nm 处荧光发射峰强度有规律减弱，荧光猝灭渐趋饱和，并且最大荧光发射峰发生红移，从340 nm红移至343 nm，表明BSA 中212 位色氨酸残基附近亲水性增强［4］，这可能是因为CF 含有葡萄糖和鼠李糖2 个糖基，极性强，水溶性好，在与BSA 结合后，使得BSA 中212 位色氨酸所处环境极性增大。同时， 462 nm 处CF 的荧光发射峰强度增大，表明CF 与BSA 之间发生相互作用，而且发生了能量转移。等发射点的存在( 423 nm) 表明为静态猝灭。

由于“内滤光效应”会引起物质荧光强度降低，Steiner［5-6］等提出，如果药物在激发和发射波长处吸收值不超过0. 3 时，内滤光效应用如下公式进行校正。

F_corr = F_obs × e^{( Aex + Aem)} /2 ( 1)

F_corr和F_obs分别代表校正后和观察到的荧光强度，A_ex和A_em则是CF 在激发和发射波长处的吸收值，本文采用此公式对内滤光效应予以校正。

2. 2 猝灭机制药物分子对蛋白荧光猝灭主要可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭作用过程遵循Stern-Volmer 方程［7-8］。

F₀ /F = 1 + K_sv［Q］ = 1 + K_qτ0

［Q］ ( 2)式中F₀和F 分别为不存在和存在药物时BSA的荧光强度; K_sv为动态猝灭常数; Kq为双分子猝灭速率常数; τ0为蛋白荧光寿命( 约10 － 8 s) ［9］; ［Q］为药物浓度。BSA 的Stern-Volmer 曲线见图3。根据Stern-Volmer 方程结合图3，分别求出了不同温度下CF 对BSA 的猝灭速率常数Kq，见表1。由于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2. 0 × 1010 L·mol － 1·s － 1［9］，从表1 中可看出CF 对BSA 猝灭过程的Kq

远大于扩散碰撞猝灭常数，并且随着温度升高，Ksv减小，所以推测猝灭不是由动态碰撞引起的，而是由于形成复合物引起的静态猝灭。数据计算过程中统一读取340 nm 下的荧光强度。

2. 3 结合参数当荧光物质与药物分子之间形成不发荧光的复合物时，可利用许多公式，如对数方程、lineweaver-Burk 方程、Scatchard 方程等来计算药物小分子与BSA 相互作用的结合常数和结合位点数。由于荧光猝灭实验中所采用的最小CF 浓度为BSA 浓度的12. 5 倍，最大的为87. 5 倍，所以采用对数方程关系式［10-11］计算蛋白与CF 相互作用的结合常数Ka和结合位点数n 是理想的，公式如下。

lg［( F0 － F) /F］ = lgKa + nlg［Q］ ( 3)根据式( 3) 并结合双对数曲线图4 可以得到CF与BSA 结合后的Ka和n，见表1。Ka数据的数量级为104，说明CF 与BSA 之间属于高亲合作用范畴。Ka和n 结果证实在生物体内CF 能够被牛血清白蛋白所转运和贮存。在所研究的药物浓度区域范围内，CF 在BSA 分子上平均具有1. 02 个结合位点，表明1 mol BSA 约与1 mol CF 分子结合。

2. 4 作用类型药物小分子和生物大分子之间的作用力主要包括氢键、范德华力、静电、疏水作用力图4 CF 的双对数曲线Fig. 4 Double-lg plots for CF等。根据反应前后热力学焓变ΔH 和熵变ΔS 的相对大小，可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型。当温度变化范围不大的时候，ΔH 可视为常数，根据如下式子可计算出小分子与生物大分子作用的有关热力学参数。

其中，ΔH 为焓变; ΔS 为熵变; ΔG 为吉布斯自由能变; T 为摄氏温度; Ka为不同温度下的结合常数，R为理想气体常数。

根据上述热力学公式结合图5 可以得到CF 与BSA 结合过程的ΔH，ΔS，ΔG，见表1。ΔG ＜ 0 表明CF 与BSA 的结合属于自发过程，ΔH ＜ 0，ΔS ＜ 0 说明CF 与BSA 之间的作用力主要表现为氢键结合［12］。ΔS ＜ 0 可认为自发过程的实现主要来自于ΔH 对ΔG 的贡献，即CF 与BSA 的结合是热驱动过程。原因可能是CF 结构中富含-OH，可与BSA 上的极性基团-NH2，-OH 等生成氢键，这种作用力随着温度的升高而减弱。另外，由于CF 含有咖啡酰基芳香环结构，所以其与蛋白相互作用过程中，二者之间的疏水作用力是不能忽略的。

2. 5 能量转移25 ℃ 时测量CF 的紫外-可见吸收光谱和BSA 的荧光光谱，2 个光谱有一定程度重叠，见图6，说明CF 与BSA 之间发生了非辐射能量转移。根据Frster 非辐射能量转移理论［13］，可粗略计算出能量转移效率E 为0. 29，CF 与BSA分子中色氨酸残基之间的距离r 为3. 09 nm，该值小于7 nm，表明CF 能够插入BSA 分子内部，形成稳定的非共价复合物。因此，静态猝灭和非辐射能量转移是导致CF 对BSA 荧光猝灭的两大主要原因。

2. 6 紫外图谱BSA 对CF 紫外吸收的影响见图7。CF 在333 nm 处有最大吸收峰。固定BSA 浓度，逐渐加入CF 溶液，发现333 nm 最大吸收峰消失，当溶液中CF 浓度远大于BSA 浓度时，333 nm峰位逐渐增加，该现象表明CF 与BSA 之间发生相互作用，与荧光实验结果相吻合。

2. 7 同步荧光光谱利用同步荧光光谱技术可以了解药物分子对蛋白质构象的影响，即通过选择合适的波长差可以将在普通荧光光谱上相互重叠的荧光峰分开，固定Δλ = 15 nm 和Δλ = 60 nm 所作出的同步荧光光谱分别表现出蛋白质的酪氨酸残基和色氨酸残基的光谱特性。25 ℃下CF 与BSA 结合过程的同步荧光扫描图见图8。BSA 分子的酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光发射强度随着CF 浓度的增加而下降，表明CF 对BSA 分子内的酪氨酸和色氨酸残基的荧光均有猝灭; 但随着CF 的加入在荧光最大发射峰280， 286 nm 处未看到明显的峰移动，表明CF 和BSA 结合过程中对BSA 中色氨酸、酪氨酸残基附近的微环境影响不大［1］

2. 8 圆二色谱25 ℃ 时CF 与BSA 体系的圆二色谱图见图9。BSA 在远紫外区208，222 nm 处有2 个负峰。当加入一定量CF 后，BSA 在208，222 nm 处的摩尔椭圆率降低，但形状和肩峰的位置未发生明显移动。这种结果的产生可能是因为CF 与BSA 结合形成复合物，对血清蛋白的α-螺旋结构产生了影响，但其二级结构仍以α-螺旋为主。以CD 谱208 nm 处的摩尔椭圆率按式( 6) 粗略计算与CF 作用前后BSA 中α-螺旋结构含量［14］。

α = { ( －［θ］208 － 4 000) － ( 33 000 － 4 000) } × 100%( 6)计算结果表明，当CF 与BSA 浓度比为10 ∶ 1时，BSA 中α-螺旋二级结构含量由55. 67% 下降为49. 32%。2. 9 位点试验竞争结合实验常用来确定药物在蛋白质上的作用位点。从CF 与BSA 的结合常数Ka，可看出CF 与BSA 的一个作用位点有很强的相互作用。蛋白质主要有2 个结合位点siteⅠ，siteⅡ［15］。为了确定CF 在BSA 上的结合位置，选择保泰松、布洛芬分别为siteⅠ， siteⅡ的标记物加入到CF-BSA 体系进行竞争实验。

运用式( 2) 计算结果显示，在保泰松或布洛芬存在的情况下，CF 与BSA 的结合常数在25 ℃时分别为2. 38 × 104， 3. 57 × 104 L·mol － 1。数据表明在保泰松存在的条件下，CF 与BSA 的结合常数明显减小，而布洛芬的存在对CF 与BSA 结合常数的影响较小，该结果说明CF 主要与保泰松竞争性结合BSA 上同一位点，而与布洛芬发生竞争性结合几率较小。所以CF 在BSA 分子上的结合位点主要与保泰松的结合位点一致，结合在疏水腔siteⅠ［16］。

2. 10 金属离子对药物和BSA 相互作用的影响本文运用式( 2) 研究了在25 ℃时4 种金属离子对CF 与BSA 结合常数的影响，结果见表2。金属离子Cu2 + ，Fe3 + ，Mg2 + ，Zn2 + 的存在均增强了CF 与BSA的结合常数，其原因可能是金属离子与CF 形成配合物的疏水性更强，易与BSA 相互作用，使得CF 与BSA 的结合常数增大［17］。结合常数的增大在一定程度上可缓冲血浆中药物的浓度，从而有利于延长药物作用的持续时间。

3 讨论

药物在体内主要与白蛋白、α-酸性糖蛋白、脂蛋白等结合，其中，大多数酸性药物主要与白蛋白结合［18］。CF 作为酸性药物，在体内应该主要与白蛋白结合。对比文献［2］中咖啡酸和BSA 的结合常数Ka( 数量级为105 ) 与CF 和BSA 的结合常数Ka( 数量级为104 ) ，发现分子结构中含糖基会使蛋白与药物的结合常数下降。原因一可能是小分子含糖基后会导致小分子极性增大，从而不利于分子通过疏水作用结合到蛋白疏水腔siteⅠ，该结论与位点实验的结果是相吻合的; 其二，小分子含糖基后会导致小分子体积增大，也不利于该分子被蛋白siteⅠ“口袋”俘获。从药代动力学的角度来分析，结构中含糖基的小分子降低了其与蛋白的结合常数，而结合常数的减小有利于药物在体内的释放，且使药物在体内的半衰期时间缩短。采用光谱学方法主要研究了生理条件下中药小分子肉苁蓉苷F 与BSA 的结合常数、结合位点数、结合作用力、作用位点、能量转移效率及猝灭机制。实验结果表明肉苁蓉苷F 不仅可以被牛血清白蛋白所贮存、运载，而且它对蛋白的二级构象有一定影响，这很可能是咖啡酸类药物具有明显抗菌、抗病毒等活性的理论依据之一。

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