张健飞，管静，赵丹，杨晓琴，周英，俸婷婷

1．贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025：

2．贵州大学医学院，贵州 贵阳 550025：

3．贵州大学生命科学学院学院，贵州 贵阳 550025：

4．贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025：

5．贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025：

6．贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025）

摘要：通过体外培养免肾小管上皮细胞，研究H2O2对细胞增殖作用及肉苁蓉提取物对H2O2致肾小管上皮细胞损伤的影响。通过细胞形态观察，采用MTT法测定H，O2对兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响及肉苁蓉水提，醇提物2、20、200mgL-三个剂量组的保护作用，测定细胞LDH释放量，结果表明，随着H，O，浓度的增加，形态改变的细胞数量逐渐增多，贴壁细胞数量逐渐减少，细胞增殖抑制率越大，细胞LDH释放量越多，呈浓度依赖性，肉苁蓉醇提物和水提物高浓度组能够显著降低H2O2对免肾小管上皮细胞增殖的抑制作用（P＜0.01），肉苁蓉醇提物和水提物的高、中、低剂量组均能使H，O2作用后兔肾小管上皮细胞LDH释放量极显著低于模型组LDH的释放量（P＜0.01），结果呈浓度依赖性。H，O，对兔肾小管上皮细胞增殖具有不同程度的影响，肉苁蓉对H，O2致兔肾小管上皮细胞损伤具有保护作用。

关键词：肉苁蓉：兔肾小管上皮细胞：细胞损伤

中图分类号：R965.2 文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2017）06-0044-05      国际DOI编码：10.15958／j．cnki．sdnyswsh．2017.06.008

前言

肉苁蓉又名疆芸、寸芸、苁蓉、查干告亚，为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma或管 花肉苁蓉 Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干 燥带鳞叶肉质茎。具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，传统用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘，为历代使用频度最高的补肾阳药物。H2O2作为一种活性氧形式，具有强烈引发脂质过氧化的作用，几乎可与任何细胞成分发生反应，引起链式脂质过氧化反应，造成细胞的凋亡和功能失调2．。实验主要通过研究肉苁蓉提取物对H2O2致兔肾小管上皮细胞增殖抑制和损伤的影响，初步探讨其对肾小管上皮细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试验药物

肉苁蓉购自四川省川南药业有限公司（批号151201)。

1.2 动物

新西兰大白兔，雄性，20日龄，购自贵州省畜牧研究所实验基地，动物许可证号：SCXK（黔）2012-001.

1.3 试剂

DMEM／F-12（1：1），Gbico 公司：胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司：二甲亚砜（DMSO），北京鼎国昌盛生物技术有限公司：H2O2，四川金山制药有限公司：胰蛋白酶，Amresco 公司：噻唑蓝（MTT），Genview 公司；非放射性细胞毒性检测试剂盒，Promega公司：无水乙醇，天津富宇精细化工有限公司。

1.4 仪器

CO2培养箱，3111型，Thermo Fisher Seientifie： 酶标仪，1510型，Thermo Fisher Seientifie：超净工作台，SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司：倒置荧光显微镜，宁波舜宇：旋转蒸发器，RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机，LGJ-12，北京松源

华兴科技发展有限公司。

1.5 方法

1.5.1 肉苁蓉提取物的制备 取肉苁蓉干药材粉碎，精密称取两份药粉各100g，分别加入10倍量蒸馏水和75％乙醇加热回流提取3次，第一次3h，第二次1.5h，第三次1h，合并3次滤液，减压浓缩至浸膏，计算提取物得膏率分别为水提物22.30％，醇提物21.70％，挥去残醇，冷冻干燥机制得肉苁蓉水、醇提取物，密封干燥避光保存待用。

1.5.2 细胞培养 参照赵丹等“所述方法构建肾小管上皮细胞模型，分离培养20日龄的兔原代肾小管上皮细胞，待细胞生长至铺满培养皿90％以上，胰酶消化。用含1％胎牛血清的DMEM／F-12完全培养基以每孔1.2x10个细胞接种于96孔板，37℃，5％CO2条件下培养。

1.5.3 H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤模型的建立 参照1.5.2接种细胞，待细胞稳定培养48h后，采用H2O2进行损伤。设置实验组和空白对照组，每组设置4个复孔，重复三次。实验组：更换含有不同浓度H2O2的完全培养基，H2O2的浓度分别为550、500、450、400、350 μmol·L-，空白对照组：更换完全培养基，37℃，5％CO2条件下继续培养24h．镜检，采集图片。采用MTT 法测定H2O2作用后细胞的增殖情况，于490nm处测定吸光度值（OD值）。采用非放射性细胞毒性检测试剂盒测定H2O2作用后细胞LDH释放量的变化，LDH释放量（％）＝上清液LDH量／（上清液LDH量＋裂解液LDH量）x100％。

AO／EB荧光染色：分别取100μg／mL．AO溶液和100μg／mL．EB溶液各100μL，混匀后每孔加入10μL，立即置于倒置相差荧光显微镜上观察，5min内保持观察视野不变，分别在450±10nm的蓝光和532±10nm的绿光下采集图片，采用荧光采集系统进行荧光合成，获得荧光染色图片。

1.5.4 肉苁蓉提取物对H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的影响 按照1.5.2接种细胞，待细胞稳定培养24h后，每孔加入含肉苁蓉提取物完全培养基200ul对细胞进行预保护培养24h．设置实验组，模型组及空白对照组，每组3个复孔，重复三次。实验组和模型组：更换含有400μmol·L-H2O2的完全培养基：空白对照组：为完全培养基。继续培养24h.采用MTT法测定细胞增殖情况，采用非放射性细胞毒性检测试剂盒测定细胞LDH释放量的改变。